SCID小鼠宣威肺癌原位模型的構建及生物學特性研究

周永春 陳艷 王熙才 劉馨 施湖濤 姚乾 金從國 伍治平 黃云超

宣威地區位于中國滇東北珠江流域源頭，當地女性肺癌的調整死亡率是全國平均水平的8倍，已成為嚴重危害人民群眾生命健康的疾病[1]，而導致肺癌患者治療失敗和死亡的主要原因是腫瘤侵襲和轉移[2]。因此，建立可靠的原位動物模型對深入研究宣威肺癌的發生和轉移機制具有重要的作用。與腫瘤的異位移植相比，原位模型的建立更能模擬肺癌在人體內的生物學特性，為研究提供相對客觀的依據[3-5]。本研究將XWLC-05宣威肺癌細胞移植到聯合免疫缺陷鼠（severe combined immunodeficiency mice, SCID）肺組織，建立肺癌原位移植模型，以探討其成瘤及轉移的生物學特性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 4周-5周齡雌雄隨機SCID小鼠72只（購自北京維通利華公司公司），許可證號為SCXK（京）2012-0001，合格證號2012-0001，體重為16 g-19.5 g，置于層流式超凈架內的有機玻璃飼養盒內（6只/盒）。飼養環境為無特定病原體級（specefic pathogen free, SPF），無菌標準飼料及飲水，環境溫度25oC-27oC，相對濕度為45%-50%，12 h光暗周期。動物無菌培養房由昆明醫科大學重點實驗室提供。接種前小鼠在動物房培養觀察1周以保證接種前生長狀況正常。定期給小鼠添加飼料、滅菌水及更換墊料，每兩天對小鼠進行體重稱量，觀察其生長及精神狀況。

1.2 細胞株 宣威肺癌細胞株XWLC-05由昆明醫科大學第一附屬醫院提供，在本實驗室常規傳代培養，實驗用細胞為第16代。

1.3 細胞生長曲線繪制及細胞懸液的制備 XWLC-05細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI1640培養液中，于37oC、含5%CO2的培養箱內培養。在滿足動物接種所需細胞量的同時，控制傳代次數，以保證細胞活力。取對數生長期的各組細胞以1.0×102個/孔接種于96孔培養板上，每組細胞設5個重復孔，放置于37oC、含5%CO2濃度的細胞培養箱中孵育4 h、2 d、5 d、7 d。按細胞增殖檢測試劑盒操作說明書進行MTS（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt）比色法檢測，培養結束后，每孔加入20 μL MTS/PMS混合液，反應1 h后，用酶標儀（Bio-Rad公司）測定490 nm處吸光度值（optical delnsity, OD），實驗重復3次。根據計數結果以OD值為縱坐標，以時間為橫坐標繪制生長曲線[6]，取第4天處于對數生長期的XWLC-05細胞（圖1），以0.25%的胰酶消化，收集細胞，離心去上清，用PBS洗滌兩次，臺盼藍染色確定細胞活力大于90%，將細胞懸浮于生理鹽水中，調整細胞濃度為2×106/mL（用于低劑量組接種）及1×107/mL（用于高劑量組接種）。

1.4 動物模型的建立

1.4.1 實驗動物分組 將72只小鼠隨機分為4組，每組18只。皮下移植：取其中兩組分別進行高劑量及低劑量接種，每組中的8只用于觀察生存，10只用于監測腫瘤及轉移情況。原位移植：取其中兩組分別進行高劑量及低劑量接種，每組中的8只用于觀察生存，10只用于監測腫瘤及轉移情況。

1.4.2 原位移植 用依托米酯注射液，按體重 0.01 mL/g腹腔內注射，小鼠經興奮煩躁期后進入麻醉狀態，仰臥固定，前胸壁酒精消毒，在左腋前線肋弓上約1.5 cm處作一約5 mm的小切口，分離皮膚及皮下組織暴露至胸壁，分別取高劑量及低劑量組50 μL（即5×105/只和1×105/只）細胞懸液與50 μL Matrigel混勻，在快凝固之前以胰島素注射針將混合懸液注入小鼠左肺，進針深度約3 mm，注射完后停針5 s，拔針后用眼科鏟針縫合切口，再次酒精消毒切口。

1.4.3 皮下移植 酒精消毒小鼠右腋下皮膚，針尖挑起皮膚，將針插入皮下注射50 μL細胞懸液，稍作停留后拔針，用棉簽輕輕壓住腋下針孔，以防止細胞懸液漏出。

1.5 移植瘤生長的觀察及測量

1.5.1 一般觀察及測量 定期觀察SCID小鼠的精神、飲食、排便、體重和活動等情況，當出現明顯體重下降、食欲不振、飲水量減少、精神萎靡、皮膚干燥及呼吸困難等現象時，脫頸處死并解剖小鼠，觀察腫瘤形成及轉移情況。原位移植組：取出原位移植瘤及腫大淋巴結、肝、脾、胰、肺、腎及腦組織，用10%甲醛固定、石蠟切片、HE染色后行光鏡下病理組織學檢查。小鼠處死前用亞甲藍0.5 mL做足墊及掌墊注射，以示蹤淋巴結。皮下移植組：于腫瘤形成后第3天開始測量腫瘤大小，用游標卡尺測量腫瘤長徑及短徑，以公式V=a2bπ/2（a為短徑，b為長徑）計算腫瘤大小，同時取出腫大淋巴結、肝、脾、胰、肺、腎及腦組織做病理組織學檢查。

1.5.2 CT掃描 小鼠處死前運用東芝64排CT對小鼠胸部進行螺旋掃描，以層厚2 mm、層間距2 mm分別重建出橫斷位及冠狀位圖像。

1.6 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，率的比較采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗，采用Kaplan-Meier法進行生存分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般觀察 小鼠于麻醉后30 min左右開始蘇醒，1 h后能夠恢復活動。實驗過程中原位移植高劑量組小鼠死亡2只，因手術操作不當導致氣胸死亡。原位移植高低劑量組小鼠分別于第13天和第25天出現消瘦、活動減少、飲食減少及倦呆乏力等惡液質表現；皮下高劑量接種組在第29天出現以上癥狀；皮下低劑量接種組狀態良好，惡液質出現較晚，最長生存期可達53天。

2.2 腫瘤形成情況

2.2.1 原位移植組 高低劑量組的成瘤率分別為81%和83%，差異無統計學意義（P=0.932），其中高劑量組于接種后第13天解剖就有腫瘤形成，且出現對側肺、胸膜腔及腋下淋巴結的廣泛轉移（圖2A，圖2B）；低劑量組于接種后第25天解剖有肺部原位腫瘤形成，腫瘤質地中等，白色，浸潤周圍組織，切面呈魚肉狀，符合肺癌的病理組織特點（圖2C，圖2D）。低劑量組淋巴結、對側肺、肝、腦、骨及腎的轉移率分別為90%、80%、60%、50%、70%、60%，與原位高劑量組相比，除淋巴結（P=0.50）和對側肺（P=0.709）外，肝（P＜0.01）、腦（P＜0.01）、骨（P＜0.01）和腎（P＜0.01）兩組的轉移率差異有統計學意義（表1）。各部位轉移病灶均經病理組織學檢查證實（圖3）。CT掃描提示原位低劑量接種組除有肺原位成瘤外，其中3只小鼠還有胸腔積液的形成（圖4）。

2.2.2 皮下移植組 高劑量組于第7天成瘤，低劑量組于第11天成瘤（其中有1只小鼠因操作不當未形成腫瘤），成瘤率分別為100%及94.5%，差異無統計學意義（P=0.791）（圖5），皮下移植高低劑量組與原位移植高低劑量組間的成瘤率比較，差異無統計學意義（P=0.365, P=0.584）。皮下腫瘤解剖后觀察：腫瘤質地中等，白色，部分有薄包膜形成，切面呈魚肉狀，部分腫瘤過大可見中央有紅黑色壞死灶（圖2E，圖2F）。高低劑量組均未發現遠處轉移，與原位高低劑量移植組相比，各部位的轉移率差異有統計學意義（P＜0.01）（表1）。

表 1 不同細胞劑量各移植組間轉移率的比較Tab 1 Comparison of metastasis rate among different groups

2.3 小鼠生存情況 原位移植組高低劑量的中位生存期（17天、27天）明顯少于皮下移植組（33天、49天），生存分析顯示皮下移植組、原位移植組組間及組內各劑量間的生存率比較差異有統計學意義（P＜0.001，圖6）。

3 討論

腫瘤實驗動物模型是人類腫瘤的復制，在腫瘤發病機制研究及治療藥物篩選等領域發揮著重要的作用。目前國內外腫瘤的實驗動物模型主要包括以下類型：①自發瘤模型，實驗動物未經任何有意識的人工處置，在自然情況下所發生的腫瘤；②誘導模型，用致癌物在動物一定部位或一定器官誘發出的腫瘤。因存在成瘤周期長、飼養動物量大、成瘤率低及耗資大等缺點，以上兩類模型多應用于職業暴露或環境污染等相關的腫瘤研究[7,8]，在常規腫瘤研究中很少運用。此外還有轉基因動物模型及目前應用最多的移植模型，用腫瘤組織或細胞移植到動物體內所形成的腫瘤動物模型，因其制作簡單、成瘤率穩定及成瘤時間短而被各實驗室廣泛運用[9]。在移植瘤模型中既往常用異位皮下移植，該方法雖然成瘤率高，但因受血供及細胞因子等微環境的限制，不能反應腫瘤在人體中的特征[10]。因此，近年來多采用原位腫瘤動物模型開展研究，它是指將人類腫瘤細胞或組織移植在動物的相應部位，因其與在人體內具有相同或相近的微環境，從而可獲得生物學行為更接近人體原發腫瘤特性的模型。在肺癌的研究中原位動物模型的接種方式又包括了支氣管內注射和肺內注射。支氣管注射操作困難、成瘤率低及瘤體的大小、數目均不穩定，其運用受到一定的限制[11]。而與之相比，肺內注射兼具了操作簡單、成瘤率高、成瘤時間短及腫瘤生長環境更符合人體情況等優點。在實驗動物的選擇上既往多采用的是BALB/c裸鼠，但因其為單免疫系統缺陷，仍有許多人類腫瘤無法在裸鼠體內移植成活[12]。本實驗中采用的SCID小鼠是嚴重聯合免疫缺陷小鼠，上世紀80年代由美國Bosma等[13]改造培殖而成，由于該小鼠為T、B 細胞聯合缺陷，對移植物免疫排斥較低，因此比單一缺損T淋巴細胞的裸鼠更適于作異體移植。Gemma等[14]及Shindo-Okada等[15]曾利用PC9、PC14及A549肺腺癌細胞系進行小鼠原位移植，除形成縱隔淋巴結轉移外，均未形成遠處器官轉移。本研究選擇云南宣威肺癌細胞株系XWLC-05進行小鼠移植，該細胞系細胞系2007年由昆明醫學院病理教研室建立，是目前唯一一株以宣威女性肺癌為來源建立的細胞系，材料取自宣威當地一位68歲的女性肺腺癌患者，病理診斷為右肺中分化腺癌。經實驗證明，該細胞系維持了原腫瘤的表型特征，能形成和宣威女性肺癌具有相同形態學特征的裸鼠移植瘤[16]，選擇該細胞作為體外研究的對象，能最大程度地反映宣威女性肺腺癌的生物學特征。

圖 1 XWLC-05細胞的生長狀態。A：光鏡下處于對數生長期的XWLC-05細胞（×200）；B：XWLC-05細胞生長曲線。Fig 1 Growth state of XWLC-05 cells. A:Cellular morphology of XWLC-05 cells (×200); B: Growth curve of XWLC-05 cells.

圖 2 原位及皮下移植瘤模型。A，B：原位高劑量XWLC-05細胞接種組小鼠顯示雙側肺和胸膜腔的廣泛浸潤轉移；C，D：原位低劑量XWLC-05細胞接種組小鼠顯示左肺境界清楚的腫瘤形成；E，F：皮下低劑量XWLC-05細胞接種組小鼠顯示皮下腫瘤的形成及腫瘤切面。Fig 2 Orthotopic transplantation and subcutaneous xenograft model. A, B: Mouse of orthotopic transplantation with high dose of XWLC-05 cells in left lung shows serious infiltration in bilateral lungs and extensive pleural metastases; C, D: Mouse of orthotopic transplantation with low dose of XWLC-05 cells in left lung shows a clear boundary tumor in left lung; E, F: Mouse of subcutaneous inoculation with low dose of XWLC-05 cells: tumor in situ and its section view.

圖 3 原位低劑量XWLC-05細胞移植組小鼠組織（HE，× 200）。A：左肺腫瘤；B：左鎖骨上淋巴結轉移性肺癌；C：右胸壁肺癌轉移灶。Fig 3 Representive tissue HE staining picture of mouse received orthotopic transplantation with low dose of XWLC-05 cells (HE, ×200). A: Tumor in left lung; B: Metastasis lymph node above left clavicle; C: The right chest wall metastases.

圖 4 原位低劑量XWLC-05細胞移植小鼠的胸部CT掃描影像。A：左肺下葉形的腫瘤；B：雙側肺門腫塊合并左側胸腔積液。Fig 4 Representive CT scan images of mouse received orthotopic transplantation with low dose of XWLC-05 cells. A: Tumor formed in left lung lower lobe; B: Bilateral hilar mass with left pleural effusion.

圖 5 皮下移植瘤生長曲線。A：高細胞劑量組；B：低細胞劑量組。Fig 5 Growth curve of subcutaneously transplanted tumor. A: High-dose group; B: Low-dose group.

圖 6 不同移植組各劑量間小鼠生存曲線Fig 6 Survival curve of mice in different groups

本次研究將XWLC-05細胞分兩組并以不同劑量分別接種于SCID小鼠皮下及肺原位，以觀察其成瘤及轉移情況。實驗結果顯示：皮下移植組無論高低劑量，小鼠在生存期內都未形成遠處轉移灶，考慮由于其周圍有結締組織包裹及生長的微環境缺乏多種與轉移相關的細胞因子，故僅能形成局部腫瘤，限制了腫瘤的浸潤及轉移。因此皮下移植形成的腫瘤不能滿足對肺癌轉移機制的研究。與皮下移植瘤相比，原位移植具有血液供應豐富及局部微環境更接近人體等優越性，不僅移植成功率高，而且更利于形成轉移[17]。在本實驗的36只原位移植的小鼠中，移植成瘤率均在80%以上，使用5×105/只高劑量細胞組的小鼠于接種后短期既形成腫瘤，且發生胸腔及對側肺的廣泛轉移，在尚未形成遠處轉移病灶前即很快死于呼吸功能衰竭，中位生存期僅有17天，不僅其發病和轉移的特點與臨床有一定的差異，且小鼠過短的生存期不利于開展轉移機制的深入研究；與之相比，使用1×105/只低劑量組細胞原位接種的小鼠生存期相對較長，亦成功形成了原位腫瘤，移植瘤發生局部浸潤、淋巴結轉移及遠處臟器轉移，且轉移率較高，部分有胸水形成，較好地保持了原始腫瘤的組織結構、細胞形態、功能及生化特征，其轉移的發生發展符合臨床肺癌患者的特點和規律，因此筆者認為該數量級細胞建立的腫瘤模型對轉移機制的研究更為理想。在原位移植中，為避免腫瘤細胞的擴散而不能形成單一的腫瘤，我們將腫瘤細胞與具有粘附性的Matrigel先混合后接種，充分保證了在局部的接種數量。

本研究以宣威肺癌XWLC-05細胞直接接種于SCID小鼠肺內，除對原位構建方法進行了優化外，還從形態學觀察、影像學檢查、病理學檢查及生存統計等層面對移植效果進行了綜合評估，成功構建了敏感、穩定及轉移特性與人體相符的原位腫瘤動物模型，為宣威肺癌及其他非小細胞肺癌轉移機制的研究及抗腫瘤藥物的開發奠定了實驗基礎。