自分泌運動因子在乳腺癌中表達情況及與預后關系

李衛民 楊振宇

1.河南省安陽縣總醫院普外一科，河南安陽 455000；2.河南省安陽市第六人民醫院胸外科，河南安陽 455000

乳腺癌是發生于乳腺的惡性腫瘤，是女性排名第一的惡性腫瘤，近年來其發病率呈逐年上升趨勢。在亞洲乳腺癌發病年齡多在45～55歲，臨床上主要采用手術切除、放化療以及內分泌的方法治療乳腺癌。目前發現乳腺癌和環境[1]（如亞硝胺[2]、病毒[3]）、飲食（缺乏維生素[4]、缺乏某些微量元素[5-6]）和遺傳因素[7]有關，但是其具體的分子機制依舊不清楚。

自分泌運動因子受體（AMFR）又名E3泛素蛋白連接酶，位于16q21，編碼323個氨基酸。AMFR主要參與組成滑面內質網的亞結構，它能在內質網中催化降解折疊錯誤的蛋白質，確保只有正確折疊的蛋白質進入分泌途徑。AMFR主要有3種配體，即自分泌運動因子AMF、神經營養因子NLK和磷酸葡萄糖異構酶PGI，AMFR和不同的配體結合能夠發揮不同的生理作用。

目前，AMFR的研究主要集中在腫瘤方面，AMFR在許多腫瘤組織特別是侵襲性或轉移性的腫瘤（如膀胱癌[8]、胃癌[9]等）中表達上調，而且AMFR的表達水平與腫瘤的侵襲、轉移和預后密切相關，AMFR表達比較高的患者其復發率和生存率也顯著高于AMFR表達低的患者。AMFR的表達情況在乳腺癌[10-11]中也有研究，但是AMFR表達和預后之間的關系則在國內研究甚少。

在本實驗中，筆者在mRNA水平和蛋白水平研究了AMFR在乳腺癌中的表達情況，分析了AMFR表達和臨床之間的關系，并對AMFR表達和生存時間之間進行了研究，探討了AMFR在乳腺癌中的診斷、治療和預后中的作用。

1 資料與方法

1.1 組織標本

為了在mRNA水平檢測AMFR的表達，筆者在2010年8月～2011年5月收集了在安陽縣總醫院普外一科手術切除的乳腺浸潤性癌及癌旁正常組織29例。手術切除的新鮮組織立即放入含有 RNAlater（Invitrogen，US）的溶液中，4℃保存過夜，以使RNAlater充分地浸入到組織中，然后-80℃凍存。

另外，還收集了80例病理診斷明確的乳腺浸潤性癌和癌旁正常組織石蠟組織塊（2003年9月～2010年10月在安陽縣總醫院普外一科手術切除），術后這些患者均未進行過系統的放化療治療。筆者在2011年6月采用電話和上門的方式對這些患者進行了隨訪，患者的生存期為3～78個月，中位生存期為33個月，其他相關的臨床資料見表1。

1.2 實時熒光定量PCR

使用 TRIZOL 試劑盒提取總 RNA（Invitrogen，US），然后使用Omniscript逆轉錄試劑盒（Qiagen，Germany）合成第一鏈的cDNA。合成第一鏈cDNA后使用Agilent2100 Bioanalyzer（Agilent technologies，US）來測量合成的第一鏈cDNA的濃度。

AMFR和內參GAPDH的引物都用Primer 5軟件合成，AMFR上游引物為5'-CACAGCGGTCAGATAGCA-3'，下游引物為5'-AAGTCCAGCGTCTCCTCC-3'，內參GAPDH的上游引物為5'-ACCCACTCCTCCACCTTTGA-3'，下游引物序列為5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCC-3'。

使用Invitrogen的實時熒光定量PCR試劑盒，實時熒光定量PCR儀器是ABI7700，PCR反應體系為20 μL，其中包括 1 μL cDNA，9 μL SYBR Green mix，上下游引物各 0.8 μL，ROX 0.4 μL，雙蒸水 8 μL、擴增條件是 95°C 孵育 2 min，然后 95°C 變性 5 s，57°C 退火 30 s，68°C 延伸 30 s，進行 40 個循環。實驗完畢后收集數據進行統計分析。

1.3 免疫組化分析及評價

對80例乳腺浸潤性癌和癌旁正常組織進行了免疫組化分析，所有的步驟均按照經典的程序來。簡單來說如下，首先進行脫蠟和水化，將石蠟切片放在二甲苯溶液中浸泡20 min，重復一次，然后使用梯度濃度的乙醇（無水乙醇、95%、90%、85%、80%）浸泡，自來水沖洗，然后在微波爐中加熱用枸櫞酸鈉緩沖液浸泡的組織切片進行抗原修復，PBS緩沖液沖洗后加入H2O2溶液滅活過氧化物酶活性，然后用非免疫性動物血清BSA 37°C進行抗原封閉30 min，棄血清后加入AMFR抗體（Abcam，Britain，1∶250 稀釋）50 μL 4°C 過夜。 最后經PBS緩沖液沖洗之后，加入生物素標記的二抗50 μL孵育30 min，再次經PBS緩沖液沖洗后加入鏈霉菌抗生素過氧化物酶溶液孵育30 min后加入DAB溶液顯色，顯微鏡下觀察掌握染色程度，最后用蘇木素復染，自來水沖洗后脫水、透明、封片和鏡檢。

實驗人員分別獨立地對這些免疫組化結果進行了評價，采用的標準如下：根據細胞染色的比例進行打分，0分為陰性，1分為陽性細胞≤10%，2分為11%～50%，3分為51%～75%，4分為>75%。染色強度打分為，0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。染色強度和染色細胞比例乘積得分如下：0，1，2，3，4，6，8，9，12。 ≤4 分認為 AMFR 蛋白表達降低，≥6分認為蛋白表達升高[12]。

1.4 統計學分析

使用SPSS 17對所有的數據進行統計分析，對實時熒光定量PCR，對乳腺癌和癌旁正常組織進行配對樣本的t檢驗；對免疫組化結果，AMFR蛋白表達和臨床特征之間關系采用卡方檢驗；對隨訪結果，使用Kaplan-Meier的方法繪制生存曲線并用log-rank進行分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺浸潤性癌和癌旁正常組織mRNA水平統計結果

對收集的29例乳腺浸潤性癌和癌旁正常組織進行統計分析，方法為配對樣本t檢驗，在29例乳腺浸潤性癌中，有23例AMFR表達高于癌旁正常組織，乳腺癌的CT均值為3.06，癌旁正常組織的CT值為4.47，配對樣本t檢驗結果t值為-3.794，P=0.001，乳腺浸潤性癌和癌旁正常組織AMFR表達差異有統計學意義。如圖1。

2.2 乳腺癌和癌旁正常組織的免疫組化分析

在正常的乳腺細胞中，AMFR的蛋白主要定位于細胞的胞漿和細胞膜，在80例乳腺浸潤性癌中，有57例AMFR表達升高，而在癌旁正常組織中，有42例AMFR蛋白表達升高，卡方檢驗結果為χ2=5.961，P=0.015，在AMFR蛋白水平，乳腺癌和癌旁正常組織表達差異有統計學意義。如圖2、3。

2.3 乳腺癌中AMFR蛋白表達和臨床之間的關系

使用卡方檢驗對AMFR蛋白在乳腺浸潤性癌表達情況與臨床特征之間的關系進行統計分析探討，在80例乳腺浸潤性癌中有57例AMFR蛋白表達升高（分數≥6分），而表達降低的僅有23例（≤4分）。通過統計發現，乳腺癌中的AMFR表達水平和病變大小（χ2=4.929，P=0.026）、T 期（χ2=9.235，P=0.010）、N 期（χ2=5.740，P=0.017）和 M 期（χ2=13.518，P<0.001）有關，而與年齡無關（χ2=0.188，P=0.665）無關。見表1。

表1 乳腺癌中AMFR蛋白表達和臨床之間的分析（n）

2.4 生存分析

筆者在2011年6月采用電話和上門的方式對這80例患者進行了隨訪，患者的生存期為3～78個月，中位生存期為33個月。為了探討AMFR表達和預后之間的關系，使用了Kaplan-Meier分析和log-rank檢驗的方法。發現AMFR表達水平和總的生存率有關，AMFR表達增高的患者生存時間比較短。AMFR表達降低的患者的平均生存期為44.73個月，中位生存期為31個月，而表達AMFR升高的患者生存期為25.651個月，中位生存期為20個月，log-rank檢驗表明這兩組之間生存率差異有統計學意義（χ2=7.071，P=0.008）。生存曲線如圖4。

3 討論

自分泌運動因子受體AMFR又名E3泛素蛋白連接酶，它能夠在內質網中清除折疊錯誤的蛋白[13]。AMFR與不同的配體結合能發揮不同的作用，目前研究發現其主要有3種配體，即：自分泌運動因子AMF、神經營養因子NLK和磷酸葡萄糖異構酶PGI。AMFR與AMF結合可以刺激細胞的運動，與腫瘤細胞的生長、轉移有關[14]；與NLK結合與神經元的生長、存活有關[15-16]；而與PGI結合則與糖代謝有關[17]。

AMFR在腫瘤中研究的比較多，在浸潤性導管癌組織中AMFR表達水平明顯高于正常乳腺上皮，組織學Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級癌組織表達強度逐漸升高，說明AMFR與乳腺癌的發生、分化程度都有關[11]；在肝癌轉移組織中，AMFR的mRNA顯著高于未轉移組，說明AMFR與腫瘤的轉移有關[18]；在胃癌中也發現了AMFR表達增加，并且AMFR與TNM分期有關[9]。此外，在膀胱癌[8]、舌癌[19]和肺癌[20]等多個組織都都有AMFR表達的升高，但是在乳腺癌中還沒有將AMFR與預后聯系的報道。

本文通過實時熒光定量PCR發現在乳腺癌中AMFR的mRNA表達顯著增加，進一步使用免疫組化的方法，發現在80例乳腺癌中有57例AMFR蛋白表達升高，與癌旁正常組織差異有統計學意義。通過與臨床特征之間分析發現，AMFR表達與病變長度、T期、N期和M期有關，但是與性別和年齡差異則無統計學意義。生存分析發現AMFR表達與患者生存率有關，AMFR表達增高的患者生存時間比較短。log-rank檢驗表明AMFR表達增高與表達降低之間生存率差異有統計學意義，說明AMFR的表達可以作為一個預后指標。

應該指出的是，由于本研究是單一醫院的回顧性研究，由于有不可測量的誤差存在而可能影響實驗結果。所以為了進一步研究清楚AMFR在乳腺癌發生發展中的作用，多中心多點的回顧性研究是必須的。

通過研究發現，AMFR在乳腺癌中表達升高，而且其表達高低還與預后有關，抑制其表達或者活性可能成為腫瘤治療的一種新方法新模式，AMFR可能也是腫瘤治療的一個新靶點和預后新指標，這需要做進一步的研究。

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