氯化血紅素對全腦缺血/再灌注大鼠海馬CA1區神經元凋亡和caspase-3表達的影響

劉 杰，郭新慶，劉輝琦，劉瑞欣，龐明泉，吳 穹

(1青海大學醫學院病理生理教研室，西寧 810001;2山東荷澤醫學專科學校;3青海大學醫學院2008級臨床本科班)

腦缺血再灌注損傷(I/R)是指腦缺血致腦細胞損傷，恢復血液再灌注后其缺血性損傷反而進一步加重的現象。海馬是腦組織邊緣系統的重要組成部分，CA1區神經元對缺血缺氧性損傷高度敏感，缺血缺氧后大量神經元死亡，其中細胞凋亡明顯。研究發現，氯化血紅素(Hemin)，即含鐵原卟啉IX，不僅用于治療貧血，且對缺血缺氧性器官損傷具有一定的保護作用［1，2］。2011 年 5 月 ～2012 年 1 月，我們觀察了不同條件下Hemin給藥對大鼠 I/R海馬CA1區神經元凋亡和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3表達的影響，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性Wistar大鼠138只，清潔級，由蘭州大學醫學院實驗動物中心提供(在我院實驗室飼養1個月，待大鼠體質量至280～330 g后開始實驗)。將138只大鼠隨機分為對照組6只，I/R組6只，預防1組～預防15組、治療1組～治療6組各6只。藥物與試劑:Hemin試劑購于美國Sigma公司，將Hemin配制為濃度60 mg/ml、pH=7.4的溶液;凋亡細胞原位細胞凋亡檢測試劑盒購自北京中昊時代生物公司;caspase-3免疫組化染色試劑盒購自武漢博士德生物工程公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備及處理 I/R組、各預防組及治療組采用傳統的Pulsinelli四血管閉塞法建立動物全腦缺血模型:10%水合氯醛360 mg/kg腹腔注射全麻、腹臥位固定，充分暴露頸背部，自雙耳前緣連線正中為起點向背部做長約1.5 cm的縱行切口，鈍性分離，暴露雙側翼狀孔，用改制的電凝器快速徹底凝閉雙側椎動脈，術畢大鼠單籠飼養;48 h后動物乙醚吸入麻醉、仰臥固定、1%普魯卡因局麻，頸前正中縱行切口，鈍性分離雙側頸總動脈，動物清醒后用夾閉雙側頸總動脈持續8 min，術后動物單籠喂養3 d。對照組只凝閉雙側椎動脈，預防組在全腦I/R前予Hemin;治療組給藥，按全腦缺血8 min恢復血液再灌注流后予Hemin，見表1。

1.2.2 檢測項目 大鼠分組造模后3 d斷頭處死動物，冰臺上迅速取腦，做成厚約4 mm、包含雙側海馬組織的冠狀切面的腦片，4%多聚甲醛液中固定48 h，嚴格按步驟進行脫水，浸蠟，包埋，連續5 μm厚連續切片，置于防脫載玻片上。①采用凋亡細胞法原位標記DNA片段檢測凋亡細胞，具體步驟參照產品說明書。②采用免疫組化染色(鏈酶菌抗生物素蛋白過氧化物酶法)檢測caspase-3表達。對切片中凋亡細胞標記陽性細胞和免疫組化顯色caspase-3陽性的海馬CAI區神經元進行計數，采用顯微計數法(400×)，隨機選取缺血海馬5個視野，計算每1 mm2區段內陽性神經元數目。凋亡細胞和caspase-3染色陽性物質均位于細胞核內，胞核呈棕黃色。

表1 各組給藥劑量、時間、途徑及次數

1.3 統計學方法 采用SPSS11.5統計軟件。數據用表示，單因素方差分析及t檢驗進行組間比較。檢驗水準α=0.05。

2 結果

各組凋亡細胞及caspase-3陽性細胞數比較見表2。

3 討論

腦是“低儲備、高供應、高消耗”的器官，腦血流量約占心輸出量的15%，腦耗氧量約占總耗氧量的23%，所以腦對缺氧十分敏感［3］。研究發現，I/R引起細胞死亡有壞死和凋亡兩種形式，凋亡為主要死亡形式，凋亡細胞的多少決定著梗死面積的大小，對缺血區域神經細胞的挽救在很大程度上依賴于在凋亡前期對凋亡啟動環節的遏制［4］。對I/R后神經元凋亡的發生機制，多數學者認為，其既是凋亡相關基因表達的結果，又受許多內外因素(如氧化損傷、細胞內鈣超載、興奮性氨基酸毒性、炎癥反應、相關的細胞因子)的調節。絕大部分細胞凋亡依賴于caspase的存在，caspases-3是凋亡的最終執行蛋白，起著最后樞紐的作用［5］:活化的caspase-3可激活細胞核的DNA酶，切割核小體間的連接，切割細胞核中lamins蛋白，瓦解核結構成核碎片，產生DNA片斷，出現核皺縮;分解與細胞骨架構成相關的蛋白，改變部分調控基因的平衡，提高促凋亡基因活性［6］。凋亡細胞法是最常用的檢測組織標本凋亡細胞的方法，但結果可能存在假陽性，所以本實驗分別用凋亡細胞原位標記法和免疫組化法檢測各組大鼠海馬CA1區神經細胞凋亡陽性個數和caspase-3表達的變化，反映I/R后海馬CA1區神經細胞凋亡程度，并探索Hemin腦神經保護作用的機制。有研究發現，大鼠I/R后caspase-3陽性細胞與凋亡陽性細胞高峰時間基本一致［7］，即I/R后24～48 h達高峰、72 h后開始下降。因此，本實驗選擇I/R后3 d進行細胞核內凋亡細胞、caspase-3基因陽性表達的檢測。

表2 各組凋亡細胞及caspase-3陽性細胞數比較(個)

Hemin是血紅素加氧酶-1的底物和促進劑，啟動HO/CO系統［8］，抵抗自由基損傷、減少EAA毒性、抗炎、抗凋亡;Hemin可提供合成腦紅蛋白(Ngb)所需的血紅素和鐵，并通過HO/CO-SGC-PKG通路上調Ngb的表達［9］，Ngb在缺血條件下可充當活性氧簇的“清道夫”，限制脂質過氧化反應，阻止神經細胞凋亡［10］。Fago 等［11］發現，Ngb 可能通過快速向Fe3+-CytoC提供1個電子使其還原為Fe2+-CytoC切斷凋亡級聯反應。張興毅等［12］發現，大鼠I/R后海馬CA1區Ngb的表達可阻止神經細胞凋亡，且與caspase-3呈負相關。因此本實驗選用Hemin不同劑量、時間、途徑、次數的預防和治療給藥，觀察對大鼠I/R海馬CA1區神經元凋亡和caspase-3表達的影響，為進一步探討Hemin的神經保護機制提供實驗依據。

司曉云等［13］發現，Hemin灌胃可對體內的HO/CO-膽紅素系統起到持續有效的誘導作用，因此本實驗采取以灌胃給藥的方式為主，未觀察動物出現不良反應，并發現灌胃療效好于腹腔注射。本研究發現，預防組和治療組凋亡細胞和caspse-3表達陽性細胞數目明顯比I/R組減少。Hemin三種不同劑量預防給藥對神經細胞的保護作用未呈現劑量依賴性，50、80 mg/kg的抗凋亡作用相近且強于20 mg/kg，推測Hemin 50 mg/kg與80 mg/kg可起到同樣的預防作用。本文還發現，Hemin給藥時間點不同，減少細胞凋亡作用強弱依次為24 h前、30 min前、48 h前給藥，推測可能與Hemin灌胃30 min后即行I/R手術，應激反應使動物胃腸血管收縮，減弱了對Hemin的吸收有關。Hemin多次預防給藥效果好于單次給藥，并出現劑量依賴性，可能與藥物的蓄積有關。但在Hemin治療用藥研究結果發現，I/R后3、6 h兩次用藥與I/R后即刻一次給藥對海馬CA1區錐體細胞均有治療作用且療效接近，推測在全腦缺血后的有效時間內盡早治療效果較好。在本研究中還發現Hemin 20 mg/kg單次預防給藥與單次治療給藥，凋亡細胞和caspse-3表達陽性細胞數目無顯著性差異，但Hemin 20 mg/kg 3次預防給藥效果好于I/R后單次和2次治療給藥，由此進一步推測選擇Hemin在I/R前多次預防給藥、全腦缺血后Hemin盡早治療給藥，對大鼠海馬CA1區或會有較好的神經保護作用。

研究結果提示，Hemin在腦缺血前后的有效時間內應用對海馬CA1區神經均有保護作用，其機制可能為抑制caspase-3表達，減少細胞凋亡。

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