大鼠PAX2真核表達質粒構建及瞬時轉染腎小管上皮細胞模型建立

李 里，吳玉斌，宮 亮

(1遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧 錦州 121000;2中國醫科大學附屬盛京醫院)

核轉錄因子(PAX2)基因編碼核轉錄因子，是腎臟胚胎發育過程中誘導腎小管上皮細胞轉分化的關鍵性發育基因之一，參與胚胎腎臟各個發育階段的調控［1，2］，成熟腎單位其表達消失。研究表明，PAX2對單側輸尿管結扎(UUO)大鼠腎小管上皮細胞EMT有調控作用，參與腎間質纖維化的病理過程，但其調控機制的研究鮮有報道。我們采用基因重組技術構建大鼠真核表達質粒(PGC-FU)-PAX2真核表達質粒并立轉染PGC-FU-PAX2使大鼠正常腎小管上皮NRK52E細胞中PAX2基因高表達，旨在為進一步研究PAX2對腎小管上皮細胞的轉分化調控機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar大鼠10只(體質量120～150 g，鼠齡2～4周，購自中國醫科大學附屬盛京醫院實驗動物中心)，PCR引物:參考GenBank的PAX2基因序列設計出1對PAX2基因編碼區擴增，引物序列:上游引物:PAX2-Age I-F GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGATATGCACTGCAAAG;下游引物:PAX2-Age I-R:TCACCATGGTGGCGACCGGGTGGCGGTCATAGGCAGC(上海吉凱基因化學技術有限公司合成)。引物說明:Age I酶切位點(下劃線標記的)。載體克隆鑒定引物PAX2-F:CTGCATCTACCAACCCTG;PAX2-R:CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG，408 bp。Trizol試劑(Invitrogen試劑公司提供);pGC-FU真核表達載體(上海吉凱基因化學有限公司)。本研究采用SPSS11.5統計軟件行統計學處理，組間數據比較采用t檢驗。檢驗水準α=0.05。

1.2 PGC-FU-PAX2真核表達質粒構建 采用左側輸尿管結扎法制備腎間質纖維化模型(梗阻性腎病模型)造模21 d處死大鼠取左腎腎皮質總RNA，用逆轉錄試劑盒合成cDNA，PCR擴增PAX2 cDNA片段，PCR 反應體系:引物 0.4 μmol/L，dNTP 1.6 mmol/L，5 × Taq buffer 4 μL，Taq 酶0.2，ddH2O 12.4 μL，Template 1 U;PCR反應條件:94℃預變性 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，30 個循環;最后72℃、10 min，擴增PCR產物大小約1294 bp，取2～5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳分析;采用純化試劑盒回收純化PCR產物。將Age I酶切回收后的PCR產物交換連接入Age I酶切的pGC-FU真核表達載體，轉化Ecoli感受態細胞，將150 μL已轉化的感受態細胞轉移到AMP抗性(100 μg/mL)的LB瓊脂培養基上，挑取單克隆進行PCR鑒定，將陽性克隆分裝200 μL，并送上海生工試劑公司測序。用針對PAX2編碼區的特異引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳分析顯示總RNA中擴增出1 kb左右的PAX2編碼區條帶，與預期大小一致。PGC-FU載體與PAX2單酶切后，提取質粒，連接，轉化，挑取單克隆，過夜培養，以PAX2-F/PAX2-R為引物進行PCR擴增，得到約408 bp左右的擴增產物，測序結果證實與模板序列一致，擴增的目的基因片段與Genebank上公布的大鼠PAX2基因序列的同源性為100%，說明目的基因和表達載體PGC-FU-PAX2真核表達質粒構建成功。

1.3 PGC-FU-PAX2真核表達質粒瞬時轉染腎小管上皮細胞模型(以下簡稱轉染模型)建立 NRK52E細胞(腎小管上皮細胞)于RPMI1640培養基(含10%胎牛血清，95%濕度，5%CO2)中37℃常規培養，每周傳代3次。將處于對數生期(細胞生長匯合至80%左右時)的NRK52E細胞用0.25%Trypsin-EDTA消化后吹打成單細胞懸液，轉染前24 h接種4×105個細胞至6孔板中，使細胞于轉染時達到90%～95%。Lipofectamine-2000(Invitrogen公司)10 μL加入240 μL無血清 RPMI1640中混勻，室溫放置5 min。取PGC-FU-PAX2質粒4 μg加入無血清RPMI1640中混勻(總量250 μL)，將以上2種液體混勻后室溫放置20 min。用無血清RPMI1640洗滌細胞3次后，將質粒—脂質體混合物逐滴滴加至細胞孔中，輕輕混勻，置37℃ 5%CO2細胞培養箱中培養。分別于轉染后24、48、72、96 h于熒光顯微鏡下計數同一視野未激發熒光時細胞總數及激發熒光時帶有綠色熒光細胞個數，計算轉染效率。轉染效率=綠色熒光細胞所占百分比=(綠色熒光細胞數/總細胞數)×100%。本實驗24 h轉染效率為(20±5)%;48 h為(30±5)%;72 h轉染效率為(50±5)%;96 h轉染效率為(10±5)%;空白對照組(不進行轉染)未見綠色熒光蛋白表達。說明轉染成功，以72 h轉染效率最高。

1.4 轉染模型PAX2基因表達測定

1.4.1 PAX2蛋白表達 采用 Western blot法。分別收集轉染后24、48、72、96 h的腎小管上皮細胞，離心沉淀后作超聲破碎處理，并使蛋白變性;SDSPAGE凝膠電泳樣品;電泳結束后采用轉移電泳裝置，于4℃，400 mA恒流條件下電轉120 min，將蛋白轉移到PVDF膜上;用封閉液(含5%脫脂牛奶的TBST溶液)室溫封閉PVDF膜1 h或4℃過夜。用封閉液稀釋的一抗抗體與封閉好的PVDF膜室溫孵育2 h或4℃過夜;TBST洗膜3次，每次10 min;室溫下用封閉液稀釋的二抗與PVDF膜孵育2 h;TBST洗膜3次，每次10 min;采用Amersham公司ECL+plusTM，Western blotting system試劑盒進行顯色;在暗房中進行獲得顯示條帶的膠片。用GAPDH作內參照驗證蛋白含量。

1.4.2 PAX2 mRNA表達 采用RT-PCR法。采用Trizol試劑，按說明書進行操作。用紫外分光光度計測260 nm/280 nm的吸光度比值及樣本濃度，檢測提取的RNA產量及質量。RNA反轉錄反應體系，經37℃ 15 min，85℃ 5 s，反轉錄合成cDNA，以此為模板用 PAX2(mRNA:NM-001106361)引物經PCR方法進行擴增。引物序列(上海生工試劑公司合成)PAX2:5'-CGGTGAGAAGAGGAAACGAG-3'，5'-GCTTGGAAGACATCGGGATA-3'，246 bp;β-actin:5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'，5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'，498 bp。擴增條件:94℃ 1 min，58 ℃ 50 s，72 ℃ 1.5 min，40 個循環;最后72℃、10 min。2%瓊脂糖凝膠電泳(75 V，1 h 20 min)，照相并保存。

2 結果

2.1 轉染模型PAX2蛋白表達 在蛋白電泳量基本相同的條件下，NRK52E細胞轉染PGC-FU-PAX2質粒后可觀察到40～50 KDa處有條特征帶，其大小與PAX2蛋白相吻合。PAX2基因插入片段，理論大小為～46 Kda(PAX2)，符合預期大小。而未轉染的對照組不顯示，其中轉染72 h蛋白表達最高(圖1)。

圖1 NRK52E細胞轉染后PAX2蛋白表達情況

2.2 轉染模型PAX2 mRNA表達 PCR示未轉染的NRK52E細胞極少 PAX2表達，而轉染后的NRK52E細胞PAX2 mRNA呈高表達，以72 h最顯著，與Western blot表達結果一致。圖像分析軟件Gene Tools分析表明，24、48、72 h均擴增出目的片段，以72 h最明顯(圖2)。

圖2 NRK52E細胞轉染后PAX2 mRNA表達

3 討論

腎間質纖維化是所有腎臟病變發展到終末期腎功能衰竭的共同病變，是慢性腎功能衰竭發展過程的始動因素［3，4］。UUO造成的腎梗阻是誘導腎間質纖維化經典的模型［5］，是目前應用最為廣泛的研究腎間質纖維化發生機制、腎臟細胞轉分化和評價腎纖維化治療效果的實驗動物模型。EMT是上皮細胞喪失成熟細胞的標志，是轉分化為胚胎間充質細胞表型，是腎間質纖維化的重要發病機制之一;阻止及逆轉EMT將會逆轉腎間質纖維化。有報道，PAX2在病理腎中出現胎兒期的回歸表達，再表達部位主要在腎小管，可能誘導EMT，參與腎臟的損傷過程。PAX2基因編碼核轉錄因子，是腎臟發育的重要調控因子［6］。后腎由輸尿管芽和后腎間充質組成，在輸尿管芽誘導下，PAX2在后腎間充質中表達，調節后出現 EMT［7，8］、形成極性細胞、分化為腎單位的各個部分，所以PAX2是間質—上皮轉化的關鍵性因子。PAX2基因突變時，間充質—上皮分化受阻，表明PAX2在誘導間充質細胞—上皮轉分化調控中起著重要作用［9］。近來發現，PAX2在病理腎組織中重新表達［10～13］。Li等［14］研究表明:在UU0模型梗阻腎中，PAX2重新表達的部位是腎小管上皮細胞，在UUO組術后3 d PAX2蛋白和mRNA在腎小管上皮細胞出現重新表達，隨著梗阻時間的延長表達更加明顯，術后14 d表達顯著，認為PAX2的再表達可能是啟動了腎臟纖維化調控機制，激活了腎小管上皮細胞轉分化的程序，其具體分子機制及信號通路有待進一步研究。

以往針對PAX2在腎纖維化方面的研究，主要集中在UUO大鼠梗阻性腎病模型，我們擬在體外進行PAX2腎小管上皮細胞轉分化的具體分子機制及信號通路進行研究，因為體內環境復雜，各通路間相互作用，相互影響。

本研究選用EGFP的PGC-FU作為報告基因，其可使目的基因在哺乳動物細胞內持續、高效表達;可采用G418篩選已成功轉染了該載體的靶細胞。從結構上看，該質粒具有很強的復制能力，并含有高效、功能強大的啟動子Ubiquitin和CMV，可以使目的基因在增生的細胞中穩定表達，具有多克隆位點，便于目的基因的插入。PGC-FU中的EGFP基因編碼GFP，在一定波長的激發光作用下可發出綠色熒光，且無需外源性物質的參與，對細胞無毒性，可觀察外源基因在活細胞中的表達，其作為理想的報告分子可借助顯微鏡進行動態觀察。本研究設計引物(插入Age I酶切位點)從21 d UUO梗阻性腎病大鼠模型中提取了大鼠PAX2的全mRNA并通過RTPCR得到全長DNA，通過電泳初步證實了該方法得到了PAX2基因，測序結果進一步證實本實驗得到的PAX2基因序列與基因庫中的結果相同，交換連接入Age I酶切的PGC-FU真核表達載體，經PCR及測序鑒定正確，即成功構建了PGC-FU-PAX2真核表達質粒。本研究通過脂質體轉染的方法，將重組質粒轉入NRK52E細胞，轉染過程中使用的脂質體轉染細胞效率較高，報告基因表達時間長，實驗中在熒光顯微鏡下觀察24 h開始出現綠色熒光，48 h綠色熒光增多，72 h熒光最為明顯，96 h后熒光減弱;通過Western blot法，RT-PCR、熒光檢測證明轉染的NRK52E細胞系在基因和蛋白水平PAX2均高表達，而未轉染的NRK52E細胞有極少量的PAX2表達。證明過表達質粒成功轉染了腎小管上皮細胞并建立了PAX2過表達的腎小管上皮細胞瞬時轉染模型。在后續的實驗中我們將觀察其是否可使腎小管上皮細胞出現轉分化;建立穩定的轉染細胞系，通過信號通路蛋白的表達探討其轉分化作用機制。本研究為闡明PAX2的轉分化作用及進一步研究對其轉分化調控機制奠定了實驗基礎。

［1］El-Nahas AM.Plasticity of kidney cells:Role in kidney remodeling and scarring［J］.Kindey Int，2003，64(5):1553-1563.

［2］Narlis M，Grote D，Gaitan Y，et al.PAX2 and Pax8 regulate branching morphogenesis and nephron differentiation in the developing kidney［J］.J Am Soc Nephrol，2007，18(4):1121-1129.

［3］Youhua L.New Insights into epithelial-mesenchymal transition in kidney fibrosis［J］.J Am Soc Nephrol，2010，(21):212-222.

［4］Rastaldi MP.Epithelial-mesenchymal transition and its implications for the development of renal tubulointerstitial fibrosis［J］.J Nephrol，2006，19(4):407-412.

［5］Picard N，Baum O，Vogetseder A，et al.Origin of renal myofibro-blasts in the model of unilateral ureter obstruction in the rat［J］.Histochem Cell Biol，2008，130(1):141-155.

［6］Narlis M，Grote D，Gaitan Y，et al.PAX2 and Pax8 Regulate branching morphogenesis and nephron differentiation in the developing kidney［J］.Am Soc Nephrol，2007，18(4):1121-1129.

［7］Grote D，Souabni A，Busslinger M，et al.PAX2/8-regulated Gata 3 expression is necessary for morphogenesis and guidance of the nephric duct in the developing kidney［J］.Development，2006，133(1):153-161.

［8］Bouchard M，Souabni A，Mandler M，et al.Nephfric lineage specification by PAX2 and Pax8［J］.Genes ＆ development，2002，16(22):2958-2970.

［9］Liu Y.Epithelial to mesenchymal transition in renal fibrogenesis:pathologic Significance，molecular mechanism，and theraintervention［J］.J Am Soc Nephrol，2004，15(1):1-10.

［10］Fukuzawa R，Eccles M，Ikeda M，et al.Embryonal hyperplasia of Bowman`s capsular epithelium in patients with WTl mutations［J］.Pediatr Nephrol，2003，18(1):9-13.

［11］Picard N，Baum O，Vogetseder A，et al.Origin of renal myofibroblasts in the model of unilateral ureter obstruction in the rat［J］.Histochem Cell Biol，2008，130(1):141-155.

［12］Letavernier E，Bruneval P，Mandet C，et al.High sirolimns levels may induce focal segmental glomerulosclerosis de novo［J］.Clin J Am Soc Nephrol，2007，2(2):326-333.

［13］皮蕾，姜儻，歐陽涓，等.PAX2基因在腎小管上皮細胞轉分化中的作用［J］.中華中醫學雜志，2007，31(1):7-10.

［14］Li L，Wu YB，Zhang WG.PAX2 re-expression in renal tubular epithelial cells and correlation with renal interstitial fibrosis of rats with obstructive nephropathy［J］.Ren Fail，2010，32(5):603-611.