實驗性變態反應性腦脊髓炎大鼠正中隆起室管膜細胞的變化及意義

劉 梅，曹翠麗，馬常升，王麗梅，王榮耕

(1河北醫科大學西山校區，石家莊 050200;2河北醫科大學基礎醫學研究所神經生物學研究室;3河北科技大學理學院)

實驗性變態反應性腦脊髓炎(EAE)的主要病理損害是脫髓鞘、血管周和腦室周圍的炎細胞浸潤及血腦屏障的破壞［1］，是人類自身免疫性疾病多發性硬化的經典動物模型，對臨床神經免疫學的研究起重要作用［2］。室周器官(CVOs)是指位于第三、四腦室壁上缺少血腦屏障的8個微小器官，它們是血攜免疫信息分子(如細胞因子等)優先入腦位點［3］，在體內參與神經內分泌和神經免疫的調節。正中隆起(ME)是重要的CVOs之一，位于下丘腦內側基底部，前后介于視交叉與垂體柄之間，正上方為第三腦室，腔面為室管膜細胞。2008年2月～2009年2月，我們采用光鏡觀察EAE大鼠不同時期ME室管膜細胞的變化及定位，進一步利用透射電鏡觀察室管膜細胞超微結構的改變，旨在探討其在EAE發病中可能的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇健康雌性Wistar大鼠20只，體質量180～200 g，普通環境飼養，保證12 h光照，12 h黑暗;成年豚鼠10只，體質量(400±20)g，由河北省實驗動物中心提供。20只大鼠隨機分為實驗組15只和對照組5只。

1.2 實驗方法 參考文獻［4］以豚鼠脊髓勻漿和完全福氏佐劑制備免疫抗原(同時加入百日咳桿菌以增加EAE的發病程度)［5］，實驗組予四肢足墊內一次性接種制作，成功標準:免疫后14～16 d發病，癥狀體征評分4分，表現為體質量減輕，食欲減退，肢體麻痹，人為將鼠翻倒后不能復位，伴或不伴有小便失禁;5分為瀕死狀態。癥狀再持續5～7 d后體征自然緩解。本實驗動物體征評分、病理結果等均符合急性EAE診斷標準，死亡率極低。對照組四肢足墊內注射生理鹽水0.4 ml。實驗組于注射后7 d(潛伏期)、14 d(發病極期，表現為肢體麻痹，人為將鼠翻倒后不能復位或瀕死狀態)、21 d(恢復期，發病后癥狀緩解者，能自如活動)分別隨機選擇5只處死，對照組于實驗21 d處死。

1.3 室管膜細胞觀察 ①光鏡:動物麻醉，常規經心灌注固定，取出整腦，冠狀方向去除視交叉前和漏斗柄后部分，取中間腦組織在4%多聚甲醛磷酸緩沖液(4 ℃)后固定24 h，然后 PBS(0.1 M，pH 7.2)沖洗3次，梯度酒精脫水，入二甲苯透明，浸蠟包塊，用Leica石蠟切片機切片，取ME部位撈片，60℃烤箱過夜。然后依次脫蠟，梯度酒精脫水，HE染色，透明封片，室溫干燥后，顯微鏡觀片，Olympus萬能顯微鏡照相。②透射電鏡:同上法取下腦塊，將腦腹面向上，于視交叉兩側各1 mm平行做兩道矢狀切口，向后至漏斗柄處做一冠狀切口，在距離腦底面3 mm處做一平行切口，取下組織即含ME，光鏡定位，觀察時腹面朝下，取ME組織塊1.0 mm×1.0 mm×2.0 mm，2.5%戊二醛前固定，然后投入1%四氧化鋨作后固定，Epon812包埋，LKB-V型超薄切片機切片，覆蓋于銅制載網，同一樣品分別制作單孔和多孔各2張銅網，醋酸鈾、拘椽酸鉛染，日立T-7500N透射電鏡觀察照相。

1.4 統計學方法 采用攝像機將切片組織圖像輸入計算機，隨機選取ME 5個不重疊視野，采用華東理工大學自動免疫組化分析系統Version2.0自動分析儀記錄細胞。數據以表示。應用SPSS10.0軟件包進行統計處理。采用單因素方差分析，有顯著差異者用q檢驗進行兩兩比較。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 光鏡觀察 光鏡下，對照組室管膜帶室管膜細胞排列整齊，呈單層或雙層，較稀疏，100×100 μm2細胞數為(12.8±1.2)個(圖①)。實驗組7 d室管膜帶室管膜細胞數目增多，排列密集，約3～5層，不規則，100 ×100 μm2細胞數為(28.2 ±1.6)個(圖②);14 d室管膜帶室管膜細胞數目明顯增多，約5～7層以上，100 ×100 μm2細胞數為(37.3 ±3.1)個(圖③)，21 d室管膜帶室管膜細胞數目與對照組相近，呈單層或雙層排列，100×100 μm2細胞數為(13.6 ±1.3)個。實驗組 14 d 每 100 ×100 μm2細胞個數明顯高于7 d，P 均 ＜0.01。

圖1 光鏡下室管膜帶室管細胞

2.2 透射電鏡觀察 對照組室管膜細胞腦室面可見微絨毛和微突起，核染色質疏松，細胞之間可見緊密連接(圖④)。實驗組7 d室管膜細胞腦室面可見微絨毛和微突起，室管膜細胞出現不同的分泌現象:有的分泌顆粒呈蘑菇形，均質狀，最大徑4.0 μm，無膜包裹(圖⑤);有的分泌顆粒結構疏松，顆粒內有大小不一的有膜囊泡，小的直徑60 nm，大的直徑180 nm，囊泡呈空泡狀，約有40～50個有膜囊泡，并可見分泌物質釋放彌散(圖⑥)。14 d室管膜細胞腦室面微絨毛變短、稀疏。室管膜細胞內線粒體形態腫脹，呈圓形、卵圓形，集中于細胞游離面。細胞內可見溶酶體吞噬現象。并觀察到室管膜細胞向外凸起，形成長橢圓形分泌顆粒，分泌顆粒有胞膜，最大徑約2.5 μm，其內有點狀顆粒，未見空泡，質地均勻，分泌顆粒有的部位胞膜破潰(圖⑦)。21 d室管膜細胞腦室面微絨毛仍較少，細胞核清晰，形態較規整，與對照組接近。

圖2 電鏡下ME室管膜細胞

3 討論

ME是腦脊液經第三腦室流入第四腦室的必由之路，從其部位、血管和神經聯系分布來看，對腦脊液成分，尤其是免疫信息分子具有重要的監控作用，是下丘腦—垂體—內分泌軸上傳下達的關鍵點［3］，當機體免疫狀態改變時會發生形態學變化，被認為在腦脊液與垂體門脈之間進行物質轉運，對垂體行使某種調控作用［6］。

呂佩源等［7］發現，血管性癡呆小鼠ME的室管膜細胞表面凹凸不平，分泌顆粒明顯減少，有皺縮現象，存在著超微結構的損傷;宋春風等［8］認為，大鼠肌肉注射醋酸可的松后，下丘腦ME室管膜細胞出現孔洞樣變化，微絨毛結構和分布異常;一氧化氮是神經系統中的信使分子，朱進霞等［9］證實ME外側帶有一氧化氮合酶陽性神經元，說明其在激素釋放和遞質的轉運中起重要作用。

本研究發現，ME室管膜帶細胞在EAE的不同時期有所改變，光鏡下潛伏期出現細胞數目增多，發病極期達到高峰，恢復期基本接近正常，其變化特點與EAE發病程度相一致;透射電鏡下潛伏期時EAE還未發病，而ME室管膜細胞即出現分泌顆粒，提示有分泌物質進入腦脊液;發病極期分泌功能旺盛，恢復期基本正常，與EAE疾病進程相一致，此形態變化顯示ME在EAE時發生病理改變早于臨床癥狀出現，且與病情進展程度呈正相關，提示該處細胞對免疫物質刺激敏感，室管膜細胞的分泌物參與了疾病進程。由此我們推斷，在EAE發病過程中，血液中激活的T淋巴細胞及其分泌物質優先通過血—腦脊液途徑進入腦脊液，經免疫—神經—內分泌網絡處理后引起ME分泌;ME分泌物質進入腦脊液，通過腦脊液—腦通路入腦，激發引起腦室周的炎性反應，此與文獻報道相一致［6］;此外ME所感受的信息又可以傳入垂體前葉，激發下丘腦—垂體—腎上腺軸，分泌腎上腺皮質激素，使機體免疫功能受抑制，反饋減少ME室管膜細胞的分泌，使恢復期細胞的形態結構基本恢復正常，說明ME室管膜細胞參與了腦內的免疫物質傳遞，從而對機體的自身免疫性反應進行調節，在免疫—神經—內分泌網絡中起重要作用。

總之，ME在EAE時發生病理改變早于臨床癥狀發生，且與病情進展程度呈正相關，提示其可能參與了腦的免疫調節。

［1］Linker RA，Sendtner M，Gold R.Mechanisms of axonal degeneration in EAE-lessons from CNTF and MHC I knockout mice［J］.Neurol Sci，2005，233(1-2):167-172.

［2］Behi ME，Dubucquoi S，Lefranc D，et al.New insights into cellresponses involved in experimental autoimmune encephalomyelitis andmultiple sclerosis［J］.Immunol Lett，2005，1(1):11-26.

［3］Gaillard RC.Interaction between the hypothalamo-pituitary-adrenal axis and the immunological system［J］.Ann Endocrinol，2001，62(2):155.

［4］董梅，劉瑞春，郭力，等.Wistar大鼠多病程實驗性變態反應性腦脊髓炎的模型建立［J］.中國免疫學雜志，2006，22(1):78-81.

［5］林嘉友.實驗性變態反應性腦脊髓炎動物模型［J］.中國神經免疫學和神經病學雜志，2003，10(1):33-34.

［6］楊天祝，賈漪濤，馬常升，等.大鼠室周器官的形態學觀察［J］.河北醫科大學學報，2002，23(3):129-132.

［7］呂佩源，尹昱，王麗，等.血管性癡呆小鼠第三腦室室管膜掃描電鏡特征觀察［J］.中國醫學物理學雜志，2004，21(5):144-146.

［8］宋春風，尹桂山，李向印，等.糖皮質激素對正中隆起室管膜細胞的影響［J］.電子顯微學報，2000，19(3):253-254.

［9］朱進霞，周明付，張華，等.一氧化氮合酶陽性神經元在大鼠下丘腦的分布［J］.河南醫科大學學報，1996，31(2):42-44.