血腫穿刺清除術對大鼠腦出血灶周組織中IL-6、TNF-α 表達的影響

劉振華，張清華，趙佳麗，王敏忠，杜怡峰

(山東大學附屬省立醫院，濟南 250021)

目前，腦出血血腫穿刺清除術的最佳時機尚無定論。單從手術角度考慮，血腫抽吸的理想時間為出血后4～8 d，此時血腫大部分液化有利于清除，但血腫對腦組織的壓迫時間過長，腦損傷恢復的可能性小。近年研究［1～3］證實，一些細胞因子或炎癥介質與出血性腦血管疾病的發生、發展有關，其中以白細胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)關系最為密切。2010～2011年，我們觀察了不同時機的血腫穿刺清除術對大鼠腦出血灶周組織中IL-6、TNF-α表達的影響，旨在為臨床手術時機的選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雄性Wistar大鼠90只，體質量260～320 g，購自山東大學實驗動物中心;大鼠腦立體定向儀，微量注射儀(購于瑞沃德生命科技有限公司)，微量注射器 (上海高鴿工貿有限公司);IL-6、TNF-α抗體(均為非結合多克隆兔抗體)SP免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒購于北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 將大鼠隨機分為對照組、模型組和手術組各30例。模型組和手術組參照Rosenberg等［4］報道的方法制備大鼠腦出血模型。術前禁食，自由飲水。用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠(350 mg/kg)，將其俯臥位固定在立體定向儀上;沿頭皮正中作一長約10 mm切口，暴露前囟;于前囟前0.2 mm中線旁開3 mm處鉆一直徑為0.5 mm的孔，進針深度為5.5 mm(尾殼核位置)。剪尾取血，在8 min內緩慢注入自體未抗凝動脈血50 μL;注血結束留針10 min后緩慢退針，局部用骨蠟封閉后縫合皮膚。對照組手術過程同上，注射等量生理鹽水。操作均在無菌條件下進行，術畢將大鼠放回籠中飼養，自由活動，進食進水。Bederson評分［5］≥2分者為造模成功。手術組在造模成功后6、12、24、48、72 h行血腫穿刺清除術(每次6只):將大鼠重新麻醉后固定在定位儀上，坐標值同前;用頭皮針連接微量注射器抽取尿激酶 10 μL［6，7］，沿鉆孔處進針深約 6.3 mm，5 min內注入尿激酶;待約45 min后用1 mL注射器代替微量注射器連接真空管外端，利用負壓輕柔緩慢抽吸血腫，抽吸量為總量的30% ～40%;緩慢退針，常規創口消毒后縫合皮膚。

1.2.2 大鼠腦出血灶周組織中IL-6、TNF-α 的檢測手術組于術后4 h、造模組和對照組均于造模后6、12、24、48、72 h 各斷頭處死 6 只大鼠，取血腫靠近皮層側(尾狀核平面)腦組織約2 mm3，用4%多聚甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋，切片厚度約4 μm。采用免疫組化SP法染色，按試劑盒說明書操作，陽性細胞為細胞質內出現黃色或棕黃色顆粒。每組隨機選取5個不重疊視野，在400倍顯微鏡下進行觀察，計數陽性細胞數，取平均值。

1.2.3 統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件。所得數據以表示，組間比較用t檢驗，多組、多時點的比較采用Post-hoc方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

不同時點各組大鼠腦出血灶周組織中TNF-α、IL-6陽性細胞數比較，見表1。

表1 不同時點各組大鼠腦出血灶周組織中TNF-α、IL-6 陽性細胞數比較(個/HP，)

表1 不同時點各組大鼠腦出血灶周組織中TNF-α、IL-6 陽性細胞數比較(個/HP，)

注:與對照組同時點比較，*P＜0.05;與模型組同時點比較，#P ＜0.05;與同組前一時點比較，△P ＜0.05

組別 TNF-α陽性細胞 IL-6陽性細胞對照組6 h 2.32 ±0.30 21.05 ±7.6212 h 2.51 ±0.51 27.23 ±11.2024 h 3.25 ±0.43 32.31 ±12.2248 h 2.96 ±0.28 37.52 ±16.2472 h 2.08 ±0.35 42.20 ±11.33模型組6 h 7.31 ±0.34* 47.83 ±16.74*12 h 23.24 ±0.81＊△ 66.29 ±18.13＊△24 h 28.17 ±0.63＊△ 68.26 ±19.22＊△48 h 21.26 ±0.55＊△ 73.82 ±19.25＊△72 h 17.06 ±0.52* 82.31 ±17.42＊△手術組6 h 4.23 ±0.51*# 34.67 ±17.21*#12 h 14.13 ±1.23*#△ 42.72 ±17.33*#△24 h 16.21 ±0.93*#△ 43.53 ±18.24*#△48 h 13.26 ±0.52*#△ 56.42 ±18.22*#△72 h 11.48 ±0.73*# 63.71 ±17.83*#△

3 討論

近年來研究［8，9］表明，自發性高血壓性腦出血后，積血釋放凝血酶、細胞毒性物質及其他分解產物，造成炎癥細胞浸潤，導致腦水腫及神經細胞凋亡和炎性因子如 IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α 等的釋放，引起附近腦組織損害，進一步造成血腦屏障的破壞。TNF-α是一種具有廣泛生物學功能的細胞因子，可通過促進凝血、增加內皮細胞通透性及誘導黏附分子或其他炎性介質等表達，增加血腦屏障的通透性，加重腦損傷。本研究結果顯示，模型組和手術組大鼠腦出血后6 h，腦出血灶周組織中TNF-α表達即增加，24 h達高峰，以后逐漸下降;而手術組TNF-α表達明顯低于模型組、高于對照組(P均＜0.05)，且以造模后6 h手術的大鼠表達最低(P均＜0.05)。提示盡早進行微創清除血腫可以減輕血腫周圍組織中TNF-α表達，從而保護神經組織。

在自發或其他因素的刺激下，淋巴細胞與多種非淋巴細胞都能產生IL-6。在中樞神經系統IL-6主要源于巨噬細胞、有活性的星形膠質細胞、小膠質細胞及神經內皮細胞等。有學者認為，正常神經細胞中IL-6保持低表達發揮中樞介導、神經修復等生理作用，但在腦出血后IL-6表達增高，參與神經損傷過程。本研究結果顯示，隨著腦出血時間的延長，模型組和手術組大鼠腦出血灶周組織中IL-6表達逐漸增加，72 h時最高。說明在腦出血急性期IL-6表達處于高水平，介導了腦出血后的腦組織損傷。

微創穿刺治療操作簡便，可以早期清除血腫，降低顱內壓，挽救患者生命，有利于腦功能康復，具有創傷小、費用少、術后康復快、技術易掌握等優點［10］，但對于微創治療最佳時機的選擇尚無定論。本研究分別在大鼠腦出血后6、12、24、48、72 h行血腫穿刺清除術，觀察不同時機手術對腦組織中TNF-α、IL-6表達的影響。結果顯示，觀察組6 h手術大鼠血腫周圍腦組織中TNF-α、IL-6的表達明顯低于其他時間手術大鼠。說明在腦出血早期即有腦內的炎癥因子激活，超早期(出血后6 h)進行血腫清除可解除血腫壓迫引起的腦損傷，還能降低血液分解產物的炎癥反應。本研究結果還顯示，腦出血后腦組織中IL-6表達高峰較TNF-α表達高峰出現的晚，可能與TNF-α激活了小膠質細胞和星形膠質細胞分泌IL-6有關。

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