單肺通氣對大鼠肺組織結構、細胞凋亡的影響及機制探討

黎 陽，易 娟，杜學柯，彭丹暉，陳肖東，黃 冰，潘靈輝，阮 林

(廣西醫科大學附屬腫瘤醫院，南寧530021)

單肺通氣(OLV)是胸科手術麻醉中常用的一種機械通氣模式。機械通氣能使炎癥級聯反應激活，通過分子生物學和細胞學效應對肺組織產生損傷。有研究［1］認為，在機械通氣早期就有肺泡上皮細胞凋亡的發生。2011年4～12月，我們觀察了OLV對大鼠肺組織細胞凋亡及凋亡執行因子Caspase-3表達的影響?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD雄性大鼠42只，體質量200～250 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供;江灣Ⅰ型微型動物呼吸機，Caspase-3兔抗鼠單克隆抗體，GAPDH內參抗體、TUNEL試劑盒、凝膠成像系統及配套分析軟件均購自美國Bio-Rad公司，多功能酶標儀購自芬蘭雷勃公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將大鼠隨機分成OLV組(A組)18只、雙肺通氣組(B組)18只及對照組(C組)6只。根據通氣時間，A、B組又各分成3個亞組，即A1(OLV 0.5 h，恢復通氣0.5 h)、A2(OLV 1 h，恢復通氣 0.5 h)、A3 組(OLV 1.5 h，恢復通氣 0.5 h)及B1(雙肺通氣1 h)、B2(雙肺通氣1.5 h)、B3 組(雙肺通氣2 h)，各6只。

1.2.2 模型制備 A組大鼠肌注氯胺酮80 mg/kg、速眠新Ⅱ0.6～0.8 mL/kg麻醉，行氣管切開并插入氣管導管至主氣管;給予維庫溴銨2 mg/kg后接呼吸機進行機械通氣，通氣參數為氧濃度(FiO2)100%、潮氣量(VT)10 mL/kg、呼吸頻率(RR)60次/min。于左側第5肋間開胸，暴露左肺;將氣管導管過深插入至右側支氣管，調節通氣參數VT 5～6 mL/kg、RR 80次/min;見左側肺葉萎陷，對側肺通氣，開始計時;至各亞組預定時間后，將氣管導管退回主氣管開始復張，恢復至雙肺通氣時的通氣參數。B組則于暴露左肺后，始終保持雙肺通氣至預定時間。C組自主呼吸。

1.2.3 標本采集 A、B組通氣至預定時間及C組麻醉后，立即頸動脈放血處死動物;分離兩側完整肺葉，置入預冷的生理鹽水中;漂洗數次以清潔表面的血跡，用濾紙吸干;取部分左肺下葉組織置入4%多聚甲醛固定48 h，脫水后石蠟包埋，做肺組織切片;將余下左肺下葉組織－80℃冰箱保存，備用。

1.2.4 檢測項目與方法 取左肺下葉組織行HE染色，光鏡下觀察肺組織形態結構的改變。Western blot法檢測100 mg超低溫保存肺組織中的Caspase-3蛋白，按試劑盒說明操作;用Image Lab凝膠圖像分析系統對膠片掃描后的反應蛋白條帶圖像進行分析，得出目標條帶的灰度值，以目標蛋白條帶灰度值與內參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示Caspase-3蛋白相對表達量。采用原位末端標記法(TUNEL)檢測肺組織的細胞凋亡，按試劑盒說明操作，細胞核呈棕黃色染色為陽性細胞;每張切片選取10個不重復視野，計算細胞凋亡指數(AI)，即每高倍視野中陽性細胞數和該高倍視野中細胞總數的比值，計算平均值。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。計量資料以±s表示，各亞組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用 LSD-t檢驗，相對應亞組間樣本比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織形態變化 C組肺組織無明顯病理改變，肺泡結構形態完整，肺泡間隔正常。B組中B1組無明顯病理改變;隨通氣時間增加，B2、B3組肺泡內可見少量滲出液，肺間質增厚。A組中A1組可見少量滲出液，肺間質增厚;A2、A3組非通氣側肺泡內可見大量紅細胞，部分肺泡腔萎陷不張，肺間質增厚明顯。

2.2 各組大鼠肺組織細胞AI及Caspase-3蛋白相對表達量比較 見表1。

表1 各組大鼠肺組織細胞AI及Caspase-3蛋白相對表達量比較(±s)

表1 各組大鼠肺組織細胞AI及Caspase-3蛋白相對表達量比較(±s)

注:與C組比較，*P＜0.05;與B組對應亞組比較，#P＜0.05

組別 AI(%) Caspase-3蛋白A 組A1 0.13±0.08 0.22±0.02 A2 6.17±0.75*# 0.34±0.01*#A3 16.00±1.10*# 0.69±0.01*#B組B1 0.15±0.10 0.22±0.01 B2 0.18±0.08 0.23±0.01 B3 4.83±0.75* 0.28±0.01*C組0.12±0.08 0.21±0.02

3 討論

OLV期間，由于非通氣側肺的血液未得到充分氧合，造成靜脈血摻雜，引起肺組織缺氧，從而導致肺組織細胞損傷以及功能損害;此外，肺萎陷后復張及在復張通氣過程中過度的牽張等，可引起一系列反應加重肺損傷［2，3］。本研究結果顯示，隨著 OLV時間延長，大鼠肺組織復張后出現肺泡結構破壞、充血水腫、肺間質逐漸增厚等組織損傷并逐漸加重。說明OLV時非通氣側肺組織受到機械牽張時間雖然短，但此后的肺復張可加重萎陷肺組織的損傷。

本研究發現，C組肺組織中未見有凋亡細胞存在，B組只有在通氣2 h的肺泡腔內側面及肺間質中見少量凋亡細胞，而A組在機械通氣1.5 h時肺組織中就已經出現凋亡細胞。在機械通氣2 h后，A組肺組織細胞的AI高于B組，提示A組肺組織中凋亡細胞的數量較B組多。在機械通氣過程中，支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞受到機械牽張的刺激，通過激活NF-κB的炎癥級聯反應而誘導細胞凋亡［1］;多種因素通過誘導肺組織細胞過度凋亡導致肺泡結構破壞，加重肺泡毛細血管膜的損傷從而參與急性肺損傷(ALI)的病理過程［4］。OLV較雙肺機械通氣易導致肺組織細胞凋亡，可能與肺組織的缺氧/低灌注、萎陷/復張有關。在OLV過程中，非通氣側肺萎陷，肺泡氧分壓下降，使得非通氣側肺組織缺氧;肺泡氧分壓下降可引起肺血管阻力增加即非通氣側肺缺氧性肺血管收縮(HPV)，是肺循環對缺氧的一種代償反應，但是HPV在起到這些保護作用的同時，也減少了肺組織的血流灌注量。Krick等［5］研究發現，在低氧的狀態下，大鼠可通過誘導缺氧誘導因子(HIF-1)引起肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡。肺組織缺氧或缺血/再灌注損傷時，組織中多形核白細胞(PMN)被激活，激活的PMN耗氧量大增，不但進一步增加組織缺氧，而且還釋放大量細胞因子和炎癥介質，可導致及加重ALI［6］。有研究表明，小腸缺血再灌注后，可通過上調TNF-α導致Ⅱ型上皮細胞凋亡從而引起ALI。OLV各亞組的左肺雖然只通氣0.5 h，但隨著肺萎陷的時間延長，肺組織中細胞凋亡數量增加。游志堅等［7］的研究也表明，兔OLV時肺組織氧化應激水平顯著升高，且隨著OLV時間的延長表現更為明顯。在非通氣側肺萎陷后復張的過程中，肺泡的膨脹并非都是協調的，膨脹和萎陷肺泡交界處產生的界面切力對肺泡壁過度牽張可引起肺泡上皮細胞的凋亡［8］。以上的研究結果提示，OLV機械通氣時，肺萎陷可能較肺機械牽張更易導致肺細胞凋亡。肺泡上皮細胞及血管內皮細胞凋亡的增加，可導致肺血管內皮屏障功能障礙［9，10］。隨著 OLV時間的延長，肺組織凋亡細胞增多，可導致肺泡和血管內皮結構破壞加重，這與本研究發現的隨著OLV時間延長，肺泡腔內出現紅細胞、肺間質水腫逐漸增厚等ALI病理改變相一致。

正常組織中的細胞凋亡對生物體的進化、內環境的穩定以及多個系統的發育起著重要作用。Caspase家族屬于天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶，與細胞凋亡密切相關。Caspase-3是其家族中最重要的一員，處于細胞凋亡的共同路徑上，是細胞凋亡的關鍵執行者之一。本研究中，C組的肺組織中出現凋亡細胞和Caspase-3蛋白表達可視為一種正常的生物學現象。Caspase-3在胞質中以無活性的酶原形式存在，只有當許多細胞外凋亡信號使之激活時，可引起細胞質、細胞核及細胞構架的關鍵蛋白酶失活，導致細胞凋亡。本研究結果顯示，各組Caspase-3蛋白表達的變化與細胞凋亡變化的趨勢大體一致。

綜上所述，隨著通氣時間的延長，OLV可導致肺組織結構的改變，并導致細胞凋亡及Caspase-3蛋白表達增加。由此推測，細胞凋亡可能是OLV導致ALI的重要因素，該作用與Caspase-3蛋白表達上調有關。更具體的作用機制還有待于進一步研究。

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