不同濃度的PMA和PDTC對星形膠質細胞NF-κB表達的影響

莫偉，陳兵*，鄒新輝，尹延慶，梁遠生，黃梓雄，談山峰，徐軍發，陳東

(1.廣東醫學院附屬醫院神經外科，廣東湛江524001；2.廣東醫學院檢驗學院，廣東湛江524023；3.廣東醫學院基礎醫學院，廣東湛江524005）

不同濃度的PMA和PDTC對星形膠質細胞NF-κB表達的影響

莫偉1，陳兵1*，鄒新輝1，尹延慶1，梁遠生1，黃梓雄1，談山峰1，徐軍發2，陳東3

(1.廣東醫學院附屬醫院神經外科，廣東湛江524001；2.廣東醫學院檢驗學院，廣東湛江524023；3.廣東醫學院基礎醫學院，廣東湛江524005）

目的探討不同濃度的PMA和PDTC對星形膠質細胞NF-κB表達的影響。方法按照不同濃度的PMA及PDTC作用對純化培養的大鼠星形膠質細胞進行分組，各組分別作用不同時間點后，運用免疫細胞化學方法進行NF-κB蛋白表達測定，進行干預因素和蛋白表達結果的相關分析。結果PMA和PDTC對星形膠質細胞NF-κB的活化和抑制作用呈現劑量與時間依賴性，24 h達高峰。結論可采用PMA及PDTC創建星形膠質細胞NF-κB蛋白不同水平表達模型。

PMA；PDTC；星形膠質細胞；NF-κB

核轉錄因子κB（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）是一類蛋白質，可調控誘導多種炎癥介質及細胞因子的表達，參與炎癥反應、細胞增殖和程序性死亡，在創傷性腦損傷的繼發性炎癥反應發生發展中起著至關重要的樞紐作用[1]。星形膠質細胞(Astrocyte，AST)是腦組織中存在最多的細胞，在NF-κB方面的研究正越來越受到重視。本文在體外純化培養星形膠質細胞的基礎上，研究NF-κB激活劑佛波醇酯（PMA）及NF-κB抑制劑吡咯醛二硫氨基甲酸（PDTC）在不同劑量與作用時間下對星形膠質細胞NF-κB的活化和抑制作用，進而探討星形膠質細胞在創傷性腦損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級新生SD大鼠200只，鼠齡為24 h內，雌雄不限，由廣東醫學院動物實驗中心飼養提供。

1.2 主要儀器和試劑胎牛血清（四季青），DMEM/F12培養基（美國GIBCO公司），胰蛋白酶，PMA，PDTC，一抗兔抗大鼠膠質原纖維酸性蛋白GFAP，一抗兔抗大鼠NF-κB多克隆抗體，二抗辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG，二抗FITC熒光標記山羊抗兔IgG，DAB顯色試劑盒（美國Sigma公司），多聚甲醛（上海化學試劑公司），蓋玻片、濕盒（武漢博士德），其他化學試劑均為國產分析純試劑。Boxun超凈工作臺（上海博迅），PH140A型培養箱/干燥器（上海一恒）ZD-85恒溫振蕩器，TP7014012熒光顯微鏡(美國Kodak公司)，LEICADM RX體視學顯微鏡(德國Leica公司)。

1.3 實驗方法新生大鼠星形膠質細胞的純化培養：取出生24 h內的SD大鼠，參照McCarthy的方法[2]加以改良，建立大鼠腦星形膠質細胞的原代培養，冰凍無菌條件下取大腦皮質，仔細的剝除軟腦膜和血管，剪碎后經0.125%胰蛋白酶37℃消化15 min，終止消化并吹打分散；100目濾網過濾后1 000 r/min× 10離心取沉淀，加完全培養基吹打制成單細胞懸液(臺盼藍計數細胞存活率為90%)。接種于玻璃培養瓶于37℃細胞培養箱內孵育30 min，翻轉培養瓶，吸取瓶中的細胞懸液；以l×l05個/cm2密度散播在預先涂有多聚左旋賴氨酸的培養瓶中培養，24 h后換液，以后每隔3 d換液一次。繼續培養12 d，待細胞鋪滿培養瓶時，以200 r/min搖床18 h以去除少突膠質細胞和小膠質細胞，用0.25%胰蛋白酶消化處理后，終止消化。孵育30 min，翻轉培養瓶，吸取瓶中的細胞懸液，以除去成纖維細胞，進行純化傳代；兩次傳代后即可得純化的星形膠質細胞[3]。采用免疫細胞化學GFAP染色進行星形膠質細胞的鑒定，純度達到95%以上的可用于實驗。

細胞分組和處理：將相同批次細胞通過傳代分為5組，將各組神經細胞以3×105/孔接種于6孔板中，培養滿意后添加藥物用于實驗，空白組予等量PBS液作用。各培養孔采用免疫細胞化學方法進行NF-κB蛋白表達測定。每批次細胞均重復3次實驗。

（1）首先進行NF-κB激活組的檢測：分別予PMA 0 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L作用于各組細胞，分別培養1 h、6 h、12 h、24 h、48 h，觀察PMA不同濃度的影響及確定NF-κB表達的高峰時間。

（2）然后進行NF-κB阻斷組的檢測：各組細胞分別預先用NF-κ B抑制劑吡咯醛二硫氨基甲酸（PDTC）0 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L處理1 h后，再加入激活組實驗中確定的有效濃度PMA，作用到NF-κB表達的高峰時間，計算PDTC有效抑制率。

（3）NF-κB蛋白表達測定：每組細胞到相應時點后收集固定，細胞爬片以1%甲醇固定(冰上15 rain)，PBS洗3次×5 min，0.1%TritonX-100的PBS室溫作用30 min；吸棄上液后，PBS洗3次×5min，細胞爬片再以用10%山羊血清室溫封閉30 min；PBS沖洗，加入一抗兔抗大鼠NF-κB多克隆抗體，4℃孵育過夜；PBS沖洗，加入用PBS稀釋的二抗FITC熒光標記山羊抗兔IgG，濕盒內避光室溫作用30 min，加入10 μl碘化丙啶染色液復染，用熒光封片劑封片。

1.4 蛋白表達的判斷標準高倍鏡下隨機觀察每組細胞5個以上有代表性視野(不少于1 000個細胞)，于Leica激光共聚焦顯微鏡下照相，并用Leica Confocal圖像分析軟件檢測核區熒光值，每組計數陽性細胞(細胞漿呈綠色熒光)與細胞總數（所有細胞的細胞核呈紅色熒光）的比值計數。評分標準：0分，沒有陽性細胞；1分，陽性細胞百分比小于10%；2分，陽性細胞百分比大于10%但小于30%；3分，陽性細胞百分比大于30%但小于60%；4分，陽性細胞百分比大于60%。

1.5 統計學處理采用SPSS13.0統計分析軟件；所有參數用均數±標準差（）表示；相同時間點的各組數據之間相互比較采用兩兩比較方差分析。檢驗水準：取α=0.05，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 倒置顯微鏡觀察星形膠質細胞形態以及純度鑒定傳代2～3次后在鏡下見較純化的星形膠質細胞：胞體較大，多呈多形性、扁平狀，胞突較多較長，細胞核呈圓形或卵圓形，偏于胞體的一側。免疫細胞化學染色后，鏡下所有細胞的細胞核為藍色，含星形膠質細胞特異抗原GFAP的細胞漿為棕黃色，標記為陽性細胞（圖1）。以隨機3個視野中陽性細胞的數日占細胞總數的比例為星形膠質細胞的純度，本實驗中培養的星形膠質細胞的純度在95%以上。

圖1 星形膠質細胞免疫細胞化學DAB染色(×100倍)

2.2 PMA對星形膠質細胞NF-κB蛋白表達的激活作用結果顯示，隨著PMA作用濃度的增加，NF-κB蛋白表達量逐漸增高，以1μmol/L組與0.5μmol/L組比較的變化最為顯著。PMA在1 μmol/L作用1 h后即可誘導NF-κB的核內表達，與空白組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。各激活組隨著作用時間增加，NF-κB蛋白表達量也逐漸增高，24 h達高峰，與空白組比較差異均有顯著的統計學意義（P＜0.01），見表1。

表1 不同濃度PMA作用不同時間后的NF-κB蛋白表達評分（，分）

表1 不同濃度PMA作用不同時間后的NF-κB蛋白表達評分（，分）

注：▲為與空白組比較，P＜0.05；■為與空白組比較，P＜0.01。

空白組0.25 μmol/L組0.5 μmol/L組1 μmol/L組2 μmol/L組0.60±0.07 0.77±0.07■1.26±0.11■3.12±0.15■3.23±0.18■0.60±0.07 0.62±0.05 0.61±0.07 0.68±0.05▲0.69±0.09▲0.60±0.07 0.63±0.06 0.70±0.10▲0.87±0.12■0.81±0.11■0.60±0.07 0.70±0.09▲0.85±0.11■1.53±0.14■1.67±0.13■0.60±0.07 0.78±0.06■1.47±0.08■3.25±0.17■3.32±0.13■

2.3 PDTC對星形膠質細胞NF-κB蛋白表達的抑制作用依照激活組實驗中確定的PMA有效濃度及作用的高峰時間，定制PMA1 μmol/L作用24 h做為對照組，抑制組加入PDTC。結果顯示，抑制組在10 μmol/L濃度PDTC作用下NF-κB蛋白表達已開始低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），20 μmol/L濃度以上與對照組比較差異有顯著統計學意義（P＜0.01），見表2。

表2 不同濃度PDTC抑制作用后NF-κB蛋白表達評分（，分）

表2 不同濃度PDTC抑制作用后NF-κB蛋白表達評分（，分）

注：▲為與對照組比較，P＜0.05；■為與對照組比較，P＜0.01。

組別對照組抑制組50 μmol/L 3.25±0.17 1.98±0.12■1 μmol/L 3.25±0.17 3.27±0.23 10 μmol/L 3.25±0.17 2.97±0.17▲20 μmol/L 3.25±0.17 2.12±0.31■

3 討論

星形膠質細胞不僅為神經元提供代謝和營養支持，而且在保護神經元存活、調節突觸功能以及神經再生和神經修復中起至關重要的作用。新近研究發現星形膠質細胞參與突觸的形成并調節突觸傳遞，參與神經的發生并與神經元之間有信息傳遞。它們在思維和學習過程中扮演著幾乎和神經元一樣重要的角色[4]，NF-κB在神經細胞損傷后的恢復過程中扮演著重要的角色[5]。NF-κB蛋白的表達主要在胞漿中，部分在細胞核中，它們具有和某些基因上啟動子區的固定核苷酸序列結合，而啟動基因轉錄的功能。NF-κB信號轉導途徑的活化與調節在干預細胞繼發性死亡方面被認為有著重要的意義。在神經系統病變如腦損傷后星形膠質細胞中與凋亡相關的多條信號轉導通路均被激活[6]，而轉錄因子NF-κB參與的信號轉導通路在其中的作用研究還有待進一步深入。因此，創建星形膠質細胞NF-κB蛋白不同水平表達模型，有助于開展星形膠質細胞在NF-κB信號通路上的機制研究，進而在改善神經系統病變導致的細胞損傷上尋找到新的治療靶點。

佛波醇酯（PMA）是蛋白激酶C（PKC）的激動劑。細胞在靜息狀態下，NF-κB以無活性的潛在狀態存在于細胞漿中，它與一種抑制因子IκB結合組成一個三聚體p50-p65-IκB。三聚體中IκB類抑制因子的存在可阻礙p50-p65復合物的二聚體化和使NF-κB的活性喪失。IκB是PKC的底物，細胞接受PKC激動劑刺激后，PKC活化的同時，可使IκB磷酸化并與NF-κB分離[7]，從三聚體中解離出來，暴露出p50亞基上的易位信號和p65亞基上的DNA結合位點，從而使此異二聚物表現出NF-κB活性，并從細胞質中易位到細胞核中，與κB基序(κB motif)相結合，從而發揮轉錄調控作用。本實驗中，在相同作用時間下，隨著PMA作用濃度的增加，星形膠質細胞中NF-κB蛋白表達量逐漸增高，1 μmol/L濃度下已能顯著提高NF-κB蛋白表達。而繼續增加PMA濃度，NF-κB蛋白表達升高已不顯著，同時光鏡下顯示細胞死亡及損傷情況明顯增加。在PMA相同濃度作用下，NF-κB蛋白表達量逐漸增高，24 h時達到高峰，隨后表達平穩后逐漸下降。

吡咯醛二硫氨基甲酸（PDTC）是一種常見的抗氧化劑，能特異性阻斷NF-κB的傳導通路。其作用機制來自兩方面：一是金屬螯合特性，二是二硫基基團清道夫作用。PDTC能抑制NF-κB的活性，從而抑制炎癥因子及粘附分子的表達，能通過抑制內毒素引起的NF-κB的活化過程而阻斷炎性細胞因子IL-6基因的表達，有可能成為炎癥疾病治療中一類很有應用前景的藥物[8]。本實驗中，PDTC在10 μmol/L濃度下已可以抑制NF-κB的活化，20 μmol/L濃度下效果較為顯著。繼續增加PDTC的濃度，有可能使星形膠質細胞損傷也相應增加。

實驗表明，PMA和PDTC對星形膠質細胞NF-κB的活化和抑制作用呈現劑量與時間依賴性。藥物作用24 h時，對NF-κB的活化和抑制作用可達到或近乎達到最高水平。因此，可采用PMA及PDTC創建星形膠質細胞NF-κB蛋白不同水平表達可控模型，有助于進行星形膠質細胞在腦功能改變及修復方面的研究。

[1]SalminenA,Huuskonen J,Ojala J,et al.Activation of innate immunity system during aging:NF-κB signaling is the molecular culprit of inflamm-aging[J].Ageing Research Reviews,2008,7(2):83-105.

[2]Mc Carthy KD,de Vellis J.Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue[J].Cell Biol, 1980,85（2）:890-902.

[3]Kliot M,Smith GM,Siegal JD,et a1.Astrocyte-po lymer implants promote regeneration of dorsal root fibers into the adult mammalian spinal cord[J]．Exp Neurol,1990,109（1）:57-69.

[4]常笑雪,張鑫.神經膠質細胞的研究進展[J].河南科技大學學報,2008,26(3):233-235.

[5]Leker RR,Shohami E.Cerebral ischemia and trauma-different etiologies yet similar mechanisms:neuron protective opportunities[J]. Brain Res Brain Res Rev,2002,39（1）:55-73.

[6]柳華東,劉爽,李卉麗,等.腦缺氧缺血后激活的信號轉導通路[J].中國生物化學與分子生物學報,2007,23（1）:33-37.

[7]楊彧,于秉治.蛋白激酶C研究的最新進展[J].生物化學與生物物理進展,1994,21(4):308-312.

[8]Crack PJ,Taylor JM.Reactive oxygen species and the modulation of stroke[J].Free RadicBiol Med,2005,38(11):1433-1444.

Effect of different concentration of PMA and PDTC on the expression of NF-ΚB in astrocytes.

MO Wei1,CHEN Bing1,ZHOU Xin-hui1,YIN Yan-qing1,LIANG Yuan-sheng1,HUANG Zi-xiong1,TAN Shan-feng1,XU Jun-fa2, CHEN Dong3.1.Department of Neurosurgery,the Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang 524001, Guangdong,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,Guangdong Medical College,Zhanjiang 524023,Guangdong, CHINA;3.Department of Basic Medicine,Guangdong Medical College,Zhanjiang 524005,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effects of different concentration of PMA and PDTC on the expression of NF-ΚB in astrocytes.MethodsRat astrocytes were effected with different concentration of PMA and PDTC for different times.The expression of NF-κB protein was determined by immunocytochemistry.Correlation analysis was performed between the intervention factors and the expression of NF-κB protein.ResultsThe effect of PMA and PDTC on NF-ΚB protein of astrocytes shows dosage dependence and time dependence,which reaches the peak at 24 hour.ConclusionPMA and PDTC could be used to set up astrocytes cell models with different levels of NF-κB protein expression.

PMA;PDTC;Astrocytes;NF-κB;Cell model

R318

A

1003—6350（2012）07—015—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.07.006

2011-12-16)

2011年廣東醫學院附屬醫院青年科研基金項目(編號：QK1112)、廣東醫學院附屬醫院優秀碩士學位論文培育計劃（編號：YS1104）

莫偉（1981—），男，廣東省陽江市人，主治醫師，碩士。

*通訊作者：陳兵，男，博士，副教授，研究方向：微創神經外科，創傷性腦損傷的基礎和臨床。E-mail：drcb@163.com