亞低溫治療對神經元興奮性毒性損傷影響的研究

王得文，李愛林

（1.永靖縣人民醫院神經內科，甘肅永靖731600；2.天津市環湖醫院，天津300060）

亞低溫治療對神經元興奮性毒性損傷影響的研究

王得文1，李愛林2*

（1.永靖縣人民醫院神經內科，甘肅永靖731600；2.天津市環湖醫院，天津300060）

目的研究谷氨酸(Glutamate,Glu)對神經元凋亡和細胞膜損傷的影響，探討亞低溫對神經元的保護作用。方法取孕14 d SD大鼠的胚胎腦組織培養神經干細胞。神經干細胞誘導分化6 d的神經元分為37℃陰性對照組(不加入谷氨酸)、37℃陽性對照組(加入50μmol/L的谷氨酸)、29℃實驗組(加入50μmol/L的谷氨酸)；同時進行的還有31℃、33℃、35℃谷氨酸損傷模型亞低溫實驗組。觀察Bax表達的變化，測定甘油(Glycerol，Gly)含量和培養液上清中乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)活力。結果(1)29℃實驗組：Bax表達29℃組最高，其次為37℃陽性組，而37℃陰性組最低；培養液上清中LDH活力和Gly均為29℃組最高，其次為37℃陽性組，37℃陰性組最低；細胞中LDH活力為29℃組最低，其次為37℃陽性組，37℃陰性組最高。(2)31℃、33℃和35℃實驗組：上清LDH活力、Gly和神經元Bax表達均為37℃陽性組最高，其次為31℃組、33℃和35℃實驗組，37℃陰性組最低；細胞中LDH活力為37℃陽性組最低，其次為31℃組，37℃陰性組最高。結論谷氨酸是導致神經細胞膜損傷和凋亡的原因之一；31℃～35℃亞低溫治療可以降低凋亡促進基因Bax的表達，減輕神經元細胞膜的損傷。

亞低溫；谷氨酸；Bax

研究表明谷氨酸(Glutamate，Glu)的興奮性毒性是導致凋亡的重要原因之一[1]，有學者已經對神經損傷后各種藥物的腦保護作用進行了研究[2]。本文通過體外培養神經元的谷氨酸損傷模型，進一步研究興奮性毒性對神經元凋亡的影響以及亞低溫治療對Glu損傷神經細胞膜的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料(1)實驗動物：孕14 d SD大鼠4只，購自軍事醫學科學院第四研究所。(2)試劑：纖維母細胞生長因子-2(FGF-2，Pepretech公司)、表皮細胞生長因子(EGF，Pepretech公司)、Nestin、MAP2、Bax和Bcl2免疫組化試劑盒(中國北京中山公司)。(3)器材：CO2培養箱(IG150，Jouan公司，法國)，倒置相差顯微鏡(NIKON，日本)，三氣培養箱(95%氮氣+5%氧氣+ 5%二氧化碳，Heraeus公司，德國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 神經細胞的培養鼠胚胎大腦神經干細胞的分離培養：取孕14 d的SD孕鼠，無菌處理后取胚胎腦組織，加等體積的0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，令其消化分散成單細胞懸液。在IMDM完全培養液中培養神經干細胞。

1.2.2 神經干細胞鑒定在培養第三代胎鼠大腦海馬NSC中干細胞巢蛋白(nestin)免疫熒光染色陽性，神經干細胞呈球體聚合狀懸浮生長，細胞團呈圓型，顯示細胞正處于未分化生長狀態，經nestin一抗和免疫熒光二抗標記呈綠色熒光球體，表明為正常生長的神經干細胞。

1.2.3 神經干細胞的誘導分化上述各組經6 d培養后收集細胞，離心棄上清，各組細胞重新懸浮于含10%FBS、N2和BDNF(20μg/L)的IMDM培養液中，接種于24孔板(已涂布明膠)，繼續培養6 d后，用4%多聚甲醛固定30 min，進行MAP2免疫組織化學染色，鑒定分化的神經元。

1.2.4 細胞存活率計算MAP2陽性率為存活的神經元。通過鏡下觀察免疫組化染色可清楚區分死亡神經元和正常神經元，這些神經元MAP2染色呈陰性，因此在進行存活神經元計數過程中，選擇胞體和突起染色均為陽性并且結構完整的細胞。

1.2.5 制做Glu損傷模型神經干細胞分化6 d的谷氨酸損傷模型亞低溫實驗分組如下：37℃陰性對照組(不加入谷氨酸)、37℃陽性對照組(加入50μmol/L的谷氨酸)、29℃實驗組(加入50μmol/L的谷氨酸)；同時進行的還有31℃、33℃、35℃谷氨酸損傷模型亞低溫實驗組。

1.2.6 乳酸脫氫酶活力測定神經元細胞培養液上清中LDH的活力(U/L)=(測定管OD值-測定空白管OD值)/(標準管OD值-標準空白管OD值)×標準管濃度(2 μmol/ml)×1 000 ml×測定前樣品稀釋倍數。細胞中LDH活力(U/gprot)=(測定管OD值-測定空白管OD值)/(標準管OD值-標準空白管OD值)×標準管濃度(2 μmol/ml)÷蛋白濃度(gprot/ml)。

1.2.7 Bax表達變化的觀察和Gly測定免疫組化染色(按ABC試劑盒程序)觀察Bax表達的變化，細胞呈棕黃色為陽性，陰性則為胞漿無色。陽性細胞計數：200×光鏡下，隨機選取6個區域，每個區域用目鏡網格測微尺計算陽性細胞密度，以陽性細胞/網格范圍內的細胞總數，分別計數細胞總數陽性細胞數，以百分率計算陽性細胞數，每組數據計算均數與標準差。微透析分析儀測定神經元培養液中Gly的含量。

1.3 統計學方法用SPSS11.5統計軟件包進行處理。各種生化成分及比率的組間差異顯著性用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組內兩兩比較用S-N-K法。

2 結果

2.1 正常培養的海馬神經元及谷氨酸對神經元的損傷作用

2.1.1 神經微管相關蛋白2(MAP2)免疫組化染色培養6 d的神經元經MAP2染色，可見胞漿被染成棕黃色，陽性率達18.21%～22.34%。

2.1.2 谷氨酸對體外培養海馬神經元形態學的影響在相差顯微鏡下觀察，37℃陽性組細胞體積變小，染色質凝聚在核膜下呈半月狀，部分軸突增粗甚至發生斷裂，細胞光暈減弱或消失，細胞膜增厚、粗糙，部分細胞死亡崩解。

2.2 亞低溫治療對Bax、LDH和Gly的影響

2.2.1 29℃實驗組亞低溫治療效果29℃亞低溫治療對細胞中LDH(U/gprot)、上清中LDH(U/L)、Gly(μmol/L)和Bax表達的影響見表1。Bax表達29℃亞低溫治療組最高，其次為37℃陽性組，而37℃陰性組最低。上清LDH活力和Gly均為29℃組最高，其次為37℃陽性組，37℃陰性組最低；細胞中LDH活力為29℃組最低，其次為37℃陽性組，37℃陰性組最高。

2.2.2 31℃實驗組亞低溫治療效果31℃實驗組亞低溫治療對細胞中LDH(U/gprot)、上清中LDH (U/L)、Gly(μmol/L)和Bax表達的影響見表2。上清LDH、Gly和神經元Bax表達均為37℃陽性組最高，其次為31℃組，37℃陰性組最低；細胞中LDH活力為37℃陽性組最低，其次為31℃組，37℃陰性組最高。

2.2.3 33℃實驗組亞低溫治療效果33℃實驗組亞低溫治療對細胞中LDH(U/gprot)、上清中LDH (U/L)、Gly(μmol/L)和Bax的影響見表3。上清LDH、Gly和神經元Bax表達均為37℃陽性組最高，其次為33℃組，37℃陰性組最低；細胞中LDH活力為37℃陽性組最低，其次為33℃組，37℃陰性組最高。

2.2.4 35℃實驗組亞低溫治療效果35℃實驗組亞低溫治療對細胞中LDH(U/gprot)、上清中LDH (U/L)、Gly(μmol/L)和Bax的影響見表4。上清LDH、Gly和神經元Bax表達均為37℃陽性組最高，其次為35℃組，37℃陰性組最低；細胞中LDH活力為37℃陽性組最低，其次為35℃組，37℃陰性組最高。

表1 29℃實驗組亞低溫治療效果()

表1 29℃實驗組亞低溫治療效果()

注：與37℃陰性組比較，*P＜0.05，差異有統計學意義；與37℃陽性組比較，#P＜0.05，差異有統計學意義。

項目上清LDH(U/L)細胞LDH(U/gprot) Gly Bax P F 301.47 567.62 26.17 168.81 37℃陽性602.0±4.27*1116.24±26.60*98.68±24.75*0.38±0.039*37℃陰性586.86±2.90 1670.24±26.60 49.78±11.07 0.12±0.008 29℃649.48±7.64*#837.47±23.68*#120.80±21.83*#0.48±0.056*#0.00 0.00 0.00 0.00

表2 31℃實驗組亞低溫治療效果()

表2 31℃實驗組亞低溫治療效果()

注：與37℃陰性組比較，*P＜0.05，差異有統計學意義；與37℃陽性組比較，#P＜0.05，差異有統計學意義。

項目上清LDH(U/L)細胞LDH(U/gprot) Gly Bax P F 324.8 187.9 11.71 178.3 37℃陽性557.73±2.67*1217.45±20.97*104.88±12.58*0.38±0.037*37℃陰性534.53±4.77 1398.52±25.10 52.13±15.77 0.12±0.009 31℃516.75±1.11*#1351.72±7.65*#76.64±31.97*#0.21±0.029*#0.00 0.00 0.00 0.00

表3 33℃實驗組亞低溫治療效果()

表3 33℃實驗組亞低溫治療效果()

注：與37℃陰性組比較，*P＜0.05，差異有統計學意義；與37℃陽性組比較，#P＜0.05，差異有統計學意義。

項目上清LDH(U/L)細胞LDH(U/gprot) Gly Bax P F 77.03 21.70 16.20 182.4 37℃陽性747.16±60.97*985.31±19.76*103.61±11.26*0.38±0.040*37℃陰性520.36±16.01 1679.38±28.56 53.41±12.49 0.12±0.009 33℃609.27±9.73*#1235.59±12.65*#73.64±25.72*#0.21±0.027*#0.00 0.00 0.00 0.00

表4 35℃實驗組亞低溫治療效果()

表4 35℃實驗組亞低溫治療效果()

注：與37℃陰性組比較，*P＜0.05，差異有統計學意義；與37℃陽性組比較，#P＜0.05，差異有統計學意義。

項目上清LDH(U/L)細胞LDH(U/gprot) Gly Bax P F 77.03 103.3 9.15 50.3 37℃陽性700.52±5.81*1476.28±9.96*110.91±24.28*0.38±0.067*37℃陰性629.89±6.04 1646.15±43.28 68.07±12.72 0.12±0.095 35℃669.85±6.83*#1640.51±13.81*#89.71±21.27*#0.22±0.059*#0.000 0.000 0.001 0.000

3 討論

3.1 Glu損傷模型的建立腦損傷體外模型能消除在體時各種復雜因素的影響，觀察某種特定細胞的病理生理變化，提供一些在體研究不能得到的信息，因此近年來倍受關注。為探討興奮性毒性物質引起腦組織特定細胞膜損傷的機制及亞低溫的治療作用，本實驗采用Meade等[3]的Glu損傷模型。

細胞系對生長條件要求較低，易于培養，可以凍存和無限傳代。細胞系持續分化的特性表明它們的基因表型和蛋自表達已與正常的細胞顯著不同，因此本研究未采用細胞系作為研究對象。神經元是終末分化細胞，分離純化十分困難，采用神經元和膠質細胞混合培養和MAP2免疫組化對培養細胞鑒定的技術，既可研究Glu對神經元的損傷作用的同時混合培養又可模擬體內真實的環境。用新生鼠直接進行神經元培養，在分離過程中可能造成細胞損傷且獲得的神經元數量較少，故本研究首先用胎鼠進行神經干細胞的培養，然后通過誘導分化獲得大量混合培養的神經元。

本研究成功制作了Glu誘導的凋亡模型。形態學觀察發現，37℃陽性組海馬細胞神經元與37℃陰性組神經元相比較，細胞體積變小，染色質凝聚在核膜下呈半月狀，部分軸突增粗甚至發生斷裂，細胞光暈減弱或消失，部分細胞死亡崩解。37℃陽性組Bax陽性細胞率顯著高于37℃陰性組，支持鏡下結果，證明Glu損傷的神經元凋亡促進基因表達活躍。

3.2 Glu的興奮性毒性及亞低溫治療的保護作用近年研究表明，在退行性疾病(如阿爾茲海默氏病、帕金森氏病)、腦缺血性損傷和腦創傷后凋亡都參與了腦細胞死亡的機制[4]。Bax基因對細胞凋亡有促進作用，本研究選擇Bax蛋白表達進行研究，以期進一步深入了解亞低溫治療對凋亡的影響。

本研究發現Glu損傷后的神經元表達顯著高于無Glu損傷的神經元，而31℃、33℃和35℃亞低溫治療可以顯著減少因Glu的興奮性毒性所致的Bax表達，提示亞低溫治療通過抑制Bax表達而減少損傷神經元的凋亡。但29℃低溫治療6 d后，Bax表達高于未治療的Glu損傷的神經元。對于亞低溫治療的安全溫度窗不同學者看法不同，Zhao等[5]通過剝奪血清的方法誘導海馬神經元凋亡，也發現與本實驗類似的結果，并認為29℃低溫治療6 d可產生凍傷作用，導致細胞凋亡。因此作者認為應慎用29℃的亞低溫治療，并對治療溫度進行更深入的研究。

乳酸脫氫酶的釋放率可以作為細胞膜損傷的標志。正常情況下釋放很少，當細胞膜的通透性增高或完整性喪失時，LDH擴散進入胞外介質。對31℃、33℃和35℃組上清中LDH的測定表明，37℃陽性組LDH最高，其次為31℃、33℃和35℃亞低溫治療組，而37℃陰性組最低；對細胞內LDH的測定則相反，37℃陽性組LDH明顯降低，37℃陰性組最高，Gly的變化與LDH相似，表明谷氨酸的興奮性毒性是造成細胞膜損傷的原因之一，亞低溫治療對谷氨酸的興奮性毒性造成的細胞膜損傷具有保護作用。29℃實驗組出現了與其他三組不同的結果，上清中29℃組LDH最高，其次為37℃陽性組，而37℃陰性組最低，表明6 d的29℃亞低溫治療不但未產生神經保護作用，反而造成了細胞膜的損傷。Alm等[6]將培養的神經細胞暴露于低濃度的神經興奮性毒素，大多數的細胞表現出染色質凝聚、凋亡小體形成等凋亡的形態學改變。本研究支持凋亡過程存在細胞膜的損傷，LDH和Gly的濃度變化提示，凋亡誘導的細胞膜損傷可引起Gly濃度升高，支持Gly可作為細胞膜損傷的標記，為臨床通過微透析監測Gly指導治療提供了依據。

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Effect of hypothermia on cell membrane damage of glutamate-induced hippocampal neurons.

WANG De-wen1, LI Ai-lin2*.1.Department of Neurology,People's Hosptal of Yongjing County,Yongjing 731600,Gansu,CHINA;2. Tianjin Huanhu Hospital,Tianjin 300060,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of Glutamate(Glu)on neuronal apoptosis and cell membranedamage,and analyze the protective effect of hypothermia on neurons.MethodsThe embryonic brain tissue from SD rats with 14 days of pregnancy were extracted and cultured for neural stem cells.After induced differentiation for 6 d, the neurons were divided into 37℃negative control group(with no Glutamate),37℃positive control group(50μmol/L Glutamate),29℃study group(50μmol/L Glutamate),31℃study group,33℃study group,35℃study group.The expression of Bax was observed,and the content of Glycerol(Gly)as well as the activity of Lactate dehydrogenase(LDH) were investigated.Results(1)The express level of Bax was highest in the 29℃study group,followed by the 37℃positive control group,and lowest in the 37℃negative control group.The activity of LDH in the culture supernatant and Gly was the highest in 29℃study group,followed by the 37℃positive control group,and lowest in the 37℃negative control group.The activity of LDH in cell was the lowest in 29℃study group,followed by the 37℃positive control group,and the highest in the 37℃negative control group.(2)The activity of LDH in the culture supernatant,Gly,the expression level of Bax were the highest in the 37℃positive control group,followed by the 31℃study group,33℃study group,35℃study group,and was the lowest in the 37℃negative control group.The activity of LDH in cell was the lowest in the 37℃positive control group,followed by the 31℃study group,and was the highest in the 37℃negative control group.ConclusionGlutamate is one of the main factors that lead to neuronal apoptosis and cell membrane damage.Hypothermia(31℃～35℃)can inhibit apoptosis and cell membrane damage,and promote the expression of Bax.

Hypothermia;Glutamate;Bax

R454.5

A

1003—6350(2012)22—024—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.22.008

2012-05-15)

王得文（1969—），男，甘肅省永靖縣人，副主任醫師。

*通訊作者:李愛林，副主任醫師，神經外科學博士。E-mail:lailwq@yahoo.com.cn