p16、β-catenin、CyclinD1在宮頸病變中的表達(dá)及其臨床意義

陳海楠，楊祖菁

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院婦科，上海200092）

p16、β-catenin、CyclinD1在宮頸病變中的表達(dá)及其臨床意義

陳海楠，楊祖菁*

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院婦科，上海200092）

目的檢測p16、β-catenin和CyclinD1在正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變（CIN）以及宮頸癌(CC)中的表達(dá)，研究其在宮頸病變發(fā)生發(fā)展過程中的作用及可能機(jī)制。方法應(yīng)用免疫組化Envision System二步法檢測p16、β-catenin和CyclinD1蛋白在正常宮頸組織(非惡性腫瘤原因切除)、CIN和CC中的表達(dá)情況，比較三種蛋白在三組間的表達(dá)強(qiáng)度，并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果p16、β-catenin和CyclinD1蛋白陽性表達(dá)在正常宮頸組織、宮頸上皮CIN和CC組三組中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00，P=0.00，P=0.00）。在正常宮頸組中三種蛋白互相之間有相關(guān)性，且呈正相關(guān)性（P=0.00，P=0.000，P=0.02）；在CIN組中，p16和β-catenin、β-catenin和CyclinD1之間有相關(guān)性，且呈正相關(guān)性（P=0.03，P=0.00），p16和CyclinD1蛋白之間有一定的相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.42＜0.05)；在CC組中三種蛋白互相之間有相關(guān)性，且呈正相關(guān)性（P=0.01，P=0.01，P=0.01）。結(jié)論p16、β-catenin和CyclinD1蛋白在宮頸組織中異常表達(dá)可能與宮頸病變的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。

宮頸癌；宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變；β-連接素；細(xì)胞周期蛋白D1；p16蛋白

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，每年其在全球的新發(fā)病例數(shù)約50萬人，由于宮頸癌而導(dǎo)致死亡的人數(shù)達(dá)23萬～29萬[1]。目前宮頸癌確切的病因尚未完全明了，雖然高危型HPV感染被認(rèn)為是它的主要病因[1]，但并非所有感染高危型HPV的患者都會發(fā)展為宮頸癌，這是由于人自身免疫機(jī)制的作用可以清除部分的病毒，且高危型HPV感染宮頸并導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生還需要其他因素的協(xié)同作用[2-3]。研究表明，宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是多因素多階段演變的結(jié)果，有多種癌基因和抑癌基因的參與[2]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和研究的深入，人們逐漸認(rèn)識到細(xì)胞周期調(diào)節(jié)紊亂可能是腫瘤發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。因此，有關(guān)細(xì)胞周期調(diào)控的相關(guān)蛋白、調(diào)控的機(jī)制與腫瘤的發(fā)生的關(guān)系、細(xì)胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)、相關(guān)的細(xì)胞周期檢測點(diǎn)逐漸成為學(xué)界研究的熱點(diǎn)問題。p16、β-catenin和CyclinD1蛋白作為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，主要作用于G1期，發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。近年來三者在宮頸病變中的單獨(dú)作用研究較多，本文主要通過檢測p16、β-catenin和CyclinD1在正常宮頸、CIN以及宮頸癌中的表達(dá)，探討其在宮頸腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的作用及可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源選取交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院2011年8月至2012年1月初診、未治宮頸癌21例；CIN 24例；正常宮頸組織22例作為對照。CIN組和宮頸癌組的標(biāo)本取自術(shù)后病變宮頸組織，正常宮頸組織則來源于因非惡性腫瘤原因（如子宮肌瘤、子宮肌腺癥等）行全子宮切除的手術(shù)的宮頸組織，全部病例組織經(jīng)病理科兩位醫(yī)師診斷確診。診斷標(biāo)準(zhǔn)符合宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。

1.2 方法所有標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm厚度切片，常規(guī)HE染色和免疫組化染色（采用S-P法）鼠抗人單克隆抗體p16、鼠抗人單克隆抗體cyclinD1、鼠抗人單克隆抗體β-catenin購自上海長島生物技術(shù)有限公司。嚴(yán)格按說明書操作，DAB顯色。以已知蛋白表達(dá)陽性的組織作為陽性對照。用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)p16陽性部位為細(xì)胞核/細(xì)胞漿，β-catenin陽性部位為細(xì)胞漿/細(xì)胞核，Cyclin D1陽性部位為細(xì)胞核。免疫組化染色陽性反應(yīng)為黃-棕黃顆粒。按許良中等[5]的研究，對染色結(jié)果采用雙評分法進(jìn)行判定，根據(jù)陽性細(xì)胞的比例和顯色強(qiáng)度兩方面決定。記分標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞數(shù)＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；顯色強(qiáng)度評分：不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩者乘積≤1為陰性，1～3為弱陽性，＞3為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。三種蛋白在各組的表達(dá)結(jié)果的比較采用兩等級資料比較的Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)；三種蛋白在各組中的兩兩相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p16在正常宮頸組織、CIN和宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)三組中p16的陽性率分別為9.09%(2/22)、83.33%(20/24)、95.24%(20/21)。陽性表達(dá)主要集中于細(xì)胞漿（圖1、圖2）。各組間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)，見表1。

表1 p16、β-catenin和CyclinD1蛋白在正常宮頸組織、CIN、宮頸癌三組中的表達(dá)(例)

圖1 CIN中p16的陽性表達(dá)(×200)圖2宮頸癌中p16的陽性表達(dá)(×200)

2.2 β-catenin在正常宮頸組織、CIN和宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)三組中β-catenin的陽性率分別為18.18%(4/22)、54.17%(13/24)、71.43%(15/21)。CIN組陽性表達(dá)主要集中于細(xì)胞漿（圖3），宮頸癌組陽性表達(dá)更多見于細(xì)胞核（圖4）。各組間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表1。

2.3 CyclinD1在正常宮頸組織、CIN和宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)三組中CyclinD1的陽性率分別為13.64%(3/22)、41.67%(10/24)、80.95%(17/21)。陽性表達(dá)主要集中于細(xì)胞核（圖5、圖6）。各組間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表1。

圖3 CIN中β-catenin的陽性表達(dá)(×200)圖4宮頸癌中β-catenin的陽性表達(dá)(×200)

圖5 CIN中Cyclin D1的陽性表達(dá)(×200)圖6宮頸癌中Cyclin D1的陽性表達(dá)(×200)

2.4 p16、β-catenin和CyclinD1蛋白在CIN、宮頸癌三組中表達(dá)的相關(guān)性使用Spearman等級相關(guān)分析法分析CIN組中p16和β-cetenin的表達(dá)有正相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.440，P＜0.05）。CIN組中β-cetenin和Cyclin Dl的表達(dá)有正相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.625，P＜0.01）。CIN組中Cyclin Dl和p16的表達(dá)無相關(guān)性(r=0.172，P＞0.05）；宮頸癌組中p16和β-cetenin的表達(dá)有正相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.568，P＜0.01）。宮頸癌組中β-cetenin和Cyclin Dl的表達(dá)有正相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.580，P＜0.01)。宮頸癌組中Cyclin Dl和p16的表達(dá)有正相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.685，P=0.01）。

3 討論

細(xì)胞生長周期為G1期-S期-G2期-M期。在此細(xì)胞周期中，G1期到S期、G2期到M期被認(rèn)為是關(guān)鍵點(diǎn)。由于G1期為控制細(xì)胞周期長短的限速期[6]，且終末分化的細(xì)胞也停留于此期，所以G1期到S期對細(xì)胞的增殖更為重要。部分細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白正是通過促進(jìn)或抑制細(xì)胞通過G1期來調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化。

β-cetenin作為一種多功能的蛋白，廣泛存在于各種類型的細(xì)胞。一方面通過與細(xì)胞膜上的鈣黏蛋白相互作用，參與細(xì)胞的粘附；另一方面作為wnt信號通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子，參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等重要的調(diào)節(jié)作用[7]。在有wnt信號時，wnt配體與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP受體)和卷曲蛋白(Fz受體)及胞質(zhì)內(nèi)的蓬亂蛋白(DV1)結(jié)合后，在軸蛋白Axin的協(xié)助下，使β-catenin多聚復(fù)合體糖原合酶激酶3β（GSK-3β）的活性受抑制，從而避免β-catenin的降解，使得β-catenin在細(xì)胞漿中積累，并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)結(jié)合形成二聚體，激活下游靶基因Cyclin D1等的轉(zhuǎn)錄，引起細(xì)胞增殖和分化失控導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[8]。Rodríguez-Sastre等[9]將正常組織與43例癌前病變組織，126例浸潤型癌進(jìn)行了免疫組化分析比較，62%癌前病變組織及70%以上的癌組織胞漿中有β-catenin的異常分布，同時在40%的癌變前組織中β-catenin胞膜表達(dá)均缺失，說明β-catenin蛋白異常表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生具有密切關(guān)系。本研究同樣顯示β-catenin在CIN組和CC組存在較高的易位表達(dá)率，陽性率分別達(dá)到54.17%和71.43%，這可能與wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，當(dāng)wnt信號不存在時，β-catenin可與細(xì)胞膜上的鈣黏蛋白結(jié)合，在胞漿內(nèi)則被有效的降解，所以在正常宮頸組織中多為正常表達(dá)；當(dāng)存在wnt信號時，β-catenin不易被降解，進(jìn)一步向細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)聚集，表現(xiàn)為易位表達(dá)，說明其易位表達(dá)與宮頸病變的進(jìn)展密切相關(guān)。

Cyclin D1作為G1期細(xì)胞周期素，以及wnt/ β-catenin信號通路調(diào)控的靶蛋白，在G1/S期轉(zhuǎn)換中起重要作用。在生理狀態(tài)下，細(xì)胞進(jìn)入S期后CyclinD1迅速分解。如CyclinD1基因激活，則CyclinD1持續(xù)高表達(dá)，將導(dǎo)致G1期縮短，提前進(jìn)人S期，繼而導(dǎo)致遺傳基因突變和染色體結(jié)構(gòu)異常的細(xì)胞獲得增殖，使細(xì)胞增殖失控，最終形成腫瘤[10-11]。古麗娜·庫爾班等[12]檢測了正常宮頸、CIN及宮頸癌組織中的CyclinD1的表達(dá)，顯示隨宮頸病變的進(jìn)展，表達(dá)強(qiáng)度逐級提高，證實(shí)CyclinD1的過度表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究也提示，CyclinD1在正常宮頸組織中呈低表達(dá)，在CIN組和宮頸癌組中表達(dá)逐漸上升，且和正常組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。推測其可使宮頸細(xì)胞調(diào)控發(fā)生紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞增生異常，對宮頸病變的發(fā)生和發(fā)展起推動作用。

本研究對wnt/β-catenin信號通路及其下游受控靶蛋白之一的CyclinD1的相關(guān)性研究顯示，兩者存在顯著的正相關(guān)性，提示wnt/β-catenin信號通路在宮頸病變的發(fā)展中起著重要作用。

編碼p16蛋白的p16基因被視為抑癌基因，在腫瘤組織中發(fā)生缺失、突變及甲基化，抑癌基因的失活也被認(rèn)為在宮頸癌的發(fā)生中起重要作用。p16基因啟動子的甲基化是常見的失活形式[13]。由于p16蛋白在CyclinD-CDK4/6-pRb-E2F調(diào)節(jié)途徑中和CyclinD1競爭CDK4/6，且具負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，故而高磷酸化的pRb增多可以導(dǎo)致p16蛋白的高表達(dá)。Benevolo等[14]報(bào)道，使用免疫組化檢測了100例宮頸組織，提示隨宮頸病變的加劇，p16蛋白陽性率逐漸升高。Nam等[15]的研究也證實(shí)，在從CIN到宮頸癌的病變過程中，p16陽性率呈上升趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究也得到了同樣的結(jié)論，即p16陽性率隨宮頸病變的加重，呈上升趨勢，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而相關(guān)性研究顯示，在CIN組中，p16和CyclinD1的相關(guān)性不明確，而在宮頸癌組中，兩者的相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也提示，隨著宮頸病變的加重，CyclinD1的陽性率進(jìn)一步上升，使得高磷酸化的pRb增多，負(fù)反饋導(dǎo)致p16陽性率也發(fā)生明顯增加。

綜上所述，宮頸癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，絕不是單一因素導(dǎo)致的結(jié)局，而是一個多階段、多基因、多因素共同參與的結(jié)果。正是由于宮頸病變是個多因的、漸進(jìn)的過程，這也給早期診斷和早期治療提供了更多的途徑和機(jī)會。對宮頸組織進(jìn)行p16、β-catenin和CyclinD1蛋白的檢測，有助于對宮頸病變的早期診斷，同時也為宮頸癌的治療提供一種新的方向。對研究對象進(jìn)行系統(tǒng)的隨訪研究，可進(jìn)一步探討三種調(diào)節(jié)蛋白對宮頸病變預(yù)后的相關(guān)性。

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Expression of p16,β-catenin,CyclinD1 in cervical lesions and their clinical significance.

CHEN Hai-nan,YANG Zu-jing*.Department of Gynecology,Xinhua Hospital Affiliated to School of Medicine of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200092,CHINA

ObjectiveTo study the role of p16,β-catenin,CyclinD1 in the pathogenesis and development of cervical disease,by investigating their expression in normal cervical tissue,cervical intraepithelial neoplasia(CIN)and cervical carcinoma(CC).MethodsThe expression of p16,β-catenin and cyclinD1 was tested by SPimmunohistochemistry in normal cervical tissue,CIN and CC.ResultsThe positive expression rates of p16,β-catenin and CyclinD1 showed statistically significant difference between normal cervical tissue,CIN and CC(P=0.00,P=0.00,P=0.00＜0.05). In normal cervical tissue,the expression of p16,β-catenin and CyclinD1 was positively correlated(P=0.00,P=0.00, P=0.02＜0.05).In CIN,the expression between p16 and β-catenin as well as that between β-catenin and CyclinD1 was positively correlated(P=0.03＜0.05,P=0.00＜0.05),while no significant correlation was found between p16 and CyclinD1(P=0.42＞0.05).In CC,the expression of p16,β-catenin and CyclinD1 was positively correlated(P=0.01, P=0.01,P=0.01＜0.05).ConclusionThe abnormal expression of β-catenin,p16 and CyclinD1 may be associated with the occurrence and development of cervical lesions.

Cervical cancer;CIN;β-catenin;CyclinD1;p16 protein

R711.74

A

1003—6350（2012）22—014—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.22.005

2012-04-18）

陳海楠（1978—），男，上海市人，主治醫(yī)師，在讀碩士，研究方向：宮頸惡性腫瘤及內(nèi)分泌。

*通訊作者：楊祖菁。E-mail:yzujing@sohu.com