鐵調素對人成骨細胞增殖、凋亡、鈣化功能的影響

陳丕績

(深圳市鹽田區人民醫院檢驗科，廣東 深圳 518081)

骨質疏松(Osteoporosis)主要指由于多種原因引發的、以單位體積內骨組織量減少為主要特點的代謝性骨類疾病[1]，隨著社會老齡化的加劇，骨質疏松的發病率越來越高，其發病緩慢，以骨骼疼痛或易于骨折為主要特征，尤以老年人發病率居高。骨質疏松進展無明顯體征，不易被患者發現，短期內無法治愈，是引發一系列骨科疾病的主要病因之一，嚴重影響患者健康和生活質量。成骨細胞目前是骨質疏松相關研究的主要組織平臺，由于骨質疏松從病理學改變方面研究，是成骨細胞中的Ⅰ型膠原分泌量明顯減少，使鈣結節形成受限，進而產生骨質的變化[2]。研究表明，鐵過量或鐵分布錯位是造成骨質疏松的一個重要因素[3]，鐵調素具有鐵過量的下調作用，因而對成骨細胞的生物活性可能存在一定的影響作用。本文通過對人成骨細胞株的培養實驗，探討鐵調素在人成骨細胞增殖、凋亡、鈣化方面的作用和影響。

1 資料與方法

1.1 成骨細胞制備 人成骨細胞(hFOB1.10)由中國科學院上海細胞所細胞庫提供，置于5%CO2和34℃環境下培養，培養基采用DMEM(高糖)：F12=1:1+10%胎牛血清+0.3‰G418(Amersco公司提供)，培養3～4 d，檢測細胞密度達90%后，使用胰蛋白酶消化，再分種于12孔的培養板上，培養板上每孔置入一塊無水乙醇處理過的圓形蓋玻片。

1.2 設備及試劑 鐵調素由日本Peptide機構生產，MTT溶液由(0.5 g MTT+100 ml磷酸緩沖液(PBS)+0.22μm濾膜過濾)自行配置，二甲基亞砜(DMSO)由上海青鴻化工有限公司提供，碧云天由BestBuo貝博生物公司提供，蔡司熒光顯微鏡由Carl Zaiss公司生產，流式細胞儀由Beckman Coulter公司生產。

1.3 分組及檢測方法

1.3.1 增殖活性 鐵調素對成骨細胞增殖活性的影響采用MTT法檢測。取置備好的血清培養液，配置hFOB1.10細胞為濃度2×104個/m細胞懸液，取96孔培養板接種，每孔100μl，于34℃、飽和濕度、15%CO2環境下培養至形成單層細胞，吸棄培養液后，取18孔分為三組，100 nmol/L組、200 nmol/L組和對照組，各6孔。100 nmol/L組加入100 nmol/L鐵調素，200 nmol/L組加入200 nmol/L鐵調素，對照組不加入鐵調素。各組均間隔24 h換液，并于培養48 h后用PBS洗滌，再分別加入無血清培養液200μl及MTT溶液200μl，4 h后吸棄培養液，再于各孔加入DMSO，采用酶聯免疫檢測儀進行吸光度OD490檢測，比較鐵調素對成骨細胞增殖的作用。

1.3.2 凋亡檢測 取置備好的血清培養液，配置hFOB1.10細胞為濃度2×105個/m細胞懸液，于6孔板接種每孔2 ml，24 h后棄培養基，分100 nmol/L組、200 nmol/L組和對照組三組，100 nmol/L組加入100 nmol/L鐵調素、200 nmol/L組加入200 nmol/L鐵調素，對照組不加鐵調素。34℃、飽和濕度、5%CO2環境下間隔24 h換液，48 h后用胰酶消化，PBS洗滌，碧云天混合于室溫孵育10 min，離心吸棄上清液，冰浴避光10 min，流式細胞儀檢測成骨細胞凋亡率。

1.3.3 鈣化功能 采用鈣結節染色法，12孔培養板上分種1×105個/孔細胞，間隔24 h行培養基更換，同樣分三組，對照組加入100μl雙蒸水，100 nmol/L組加入100 nmol/L鐵調素、200nmol/L組加入200nmol/L鐵調素。間隔24 h更換培養基，15 d棄培養基，以4%多聚甲醛行30 min固定，后PBS洗滌2～3次，加入5%硝酸銀，置于陽光下暴曬30 min，再次PBS洗滌，加入5%硫代硫酸鈉靜置2 min，PBS再次漂洗2～3次，1%中性紅復染，10 min后PBS洗滌兩次，于光學顯微鏡下對各組鈣結節形成情況進行觀察。

1.4 統計學處理 采用SPSS13.0統計學處理軟件包進行數據分析，計量資料采用均值±標準差(±s)表示，F檢驗。P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 成骨細胞增殖活性 MTT法檢測結果詳見表1，三組成骨細胞增殖活性接近，經統計學比較差異無統計學意義(F=2.38，P＞0.05)。

2.2 成骨細胞凋亡檢測 隨著鐵調素劑量的減少，成骨細胞凋亡率逐漸增高，數據經統計學比較差異具有統計學意義(F=12.28，P＜0.05)，見表1。

2.3 成骨細胞鈣結節形成 利用鐵調素分組實驗15 d后，染色的三組經觀察可見細胞外基質礦化鈣結節形成，利用光學顯微鏡觀察，鈣化灶呈黑色，散點狀分布且不均勻。采用顯微鏡標尺和培養板密度共同測量成骨細胞鈣結節數量，結果見表1，隨著鐵調素干預的減少，鈣結節計數呈下降趨勢，三組成骨細胞鈣結節計數經統計學比較差異具有統計學意義(F=18.28，P＜0.01)。

表1 三組細胞增殖活性、凋亡檢測及鈣結節計數比較（±s）

表1 三組細胞增殖活性、凋亡檢測及鈣結節計數比較（±s）

組別200 nmol/L組100 nmol/L組對照組成骨細胞增殖活性(nmonl/L)0.74±0.140.72±0.230.73±0.09成骨細胞凋亡率(%)2.38±0.334.96±0.417.32±0.32成骨細胞鈣結節計數(個)287±15145±945±6

3 討論

鐵調素又被稱為“肝臟抗菌多肽”，21世紀初才經由兩個獨立實驗室分別從人類血清及尿液中提取而成[3]。研究表明鐵調素對于人體內鐵元素狀態的調節以及腸道內鐵吸收的活性有著十分關鍵的作用[4]。鐵元素廣泛的參與到人體肌紅蛋白、血紅蛋白的合成當中，是細胞色素氧化酶的組成成分，對線粒體電子傳遞有參與作用，為三羧酸循環中的酶及其他因子提供有效的鐵環境，對人體的代謝及呼吸功能有很大的影響效應[5]。近些年來，隨著骨科病理研究的不斷深入，發現成骨細胞內Ⅰ型膠原的分泌減少和鈣結節的形成減少是骨質疏松的主要成因，在骨重建系統中，成骨細胞的激活對于鐵元素具有很強的敏感性，但巨噬細胞分化形成的破骨細胞，卻能夠在大量的鐵沉積環境下正常生長，促使鐵過量或鐵分布錯位成為骨質疏松的一個重要誘發因素[6]。因而，鐵調素對鐵過量或鐵分布錯位的有效調節可能為成骨細胞的生長提供良好的體內環境，對骨質疏松有較好的病理學改善作用。

張鵬等[7]針對鐵動態平衡改變對骨代謝的影響做了實驗性研究，結果表明不同鐵調素的干預可引起鈣離子不同熒光強度的反應，隨著hFOB1.10外鐵調素濃度的增加，鈣離子更大量的向細胞內轉運，而hFOB1.10外鐵離子濃度的下降能夠促進鈣離子轉運至細胞內，說明通過鐵調素降低鐵離子的含量，可促進成骨細胞對鈣的吸收。劉樹欣等[8]的報道則對細胞鐵代謝相關性的研究進展進行了概述與總結，文章指出，鐵調素已被證實對于十二指腸的鐵吸收、控制組織細胞內的鐵穩定和促進巨噬細胞內的鐵釋放有較好作用。趙東陽等[9]的研究提示鐵調素的干預對細胞內鐵離子含量有明顯影響，且其影響在0～100 nmol/L的范圍內有明顯的劑量依賴性。

本研究主要從骨科角度對鐵調素與成骨細胞相關性進行了實驗研究，并細致的將成骨細胞化分為增殖、凋亡、鈣化三個階段，結果表明，鐵調素的干預對于成骨的增殖無顯著影響，但對其凋亡和鈣化作用明顯。隨著鐵調素用量的增加，成骨細胞凋亡率明顯降低，而鈣化計數明顯增高，提示鐵調素對于促進骨質內部的鈣吸收、減少骨細胞損傷和凋亡具有重要的促進作用。骨質疏松已經成為嚴重危害老年人健康與生活質量的常見疾病[10]，由于其發展緩慢，不易迅速表現為明顯的體征而被患者關注。臨床對骨質疏松的治療應從病理學角度增強患者的骨能量，促進骨鈣的吸收，使骨密度逐漸提升并獲得較好的細胞營養作用。鈣化能力的增強及凋亡的減少，是成骨細胞生長和改善患者骨質狀況的必要條件，從而減輕老年骨質疏松患者的痛苦，提高生活質量，延長壽命。總之，鐵調素對于成骨細胞有著較好的促生長作用，能夠有效調節人體內鐵元素環境，對于進一步研究骨質疏松的防治具有重要參考價值。

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