SCN5A基因變異與左心室肌致密化不全心力衰竭相關性研究

單麗沈，于憲一，邢艷琳，市田蕗子

(1.中國醫科大學盛京醫院 兒科，遼寧 沈陽 110004;2.日本富山大學附屬醫院 兒科，日本 富山 9300194)

心室肌致密化不全(left ventricular noncompaction，LVNC)是一種尚未分類的心肌疾病［1］，其病理特征為左心室存在大量網狀的肌肉柱形成的肌小梁及小梁間深深的間隙。目前認為，LVNC是胚胎時期心室肌致密化過程障礙所致［2］。該病可以兼有擴張性心肌病或肥厚性心肌病的臨床特征，臨床表現多樣，可以從無癥狀到嚴重的心功能障礙以致需心臟移植，甚至死亡。多數LVNC患者存在各種心律失常及不同程度的心力衰竭［2］。

1984年Engberding等［3］報道了首例無合并其他心臟畸形的LVNC。近年來，有研究［4-6］報道了一些與LVNC相關的基因，如DTNA、TAZ和LDB3等，證實了LVNC也是一種具有遺傳異質性的疾病。

現已證實，人類心臟鈉通道alpha亞單位SCN5A基因突變與長 QT 綜合征(LQTS)［7］、Brugada 綜合征［8］、不明原因的夜間猝死綜合征［9］、特發性心室顫動［10］、先天性病態竇房結綜合征［11］、心臟傳導缺陷(CCD)［12］及嬰兒猝死綜合征［13］等心律失常相關。最近發現SCN5A變異［14-15］和編碼心肌鉀通道基因KATPchannel gene(ABCC9)［16］與擴張性心肌病有關。鈉通道在心肌細胞興奮性中扮演重要角色。它建立除極與復極電流的精細平衡，從而決定動作電位間期。因此，SCN5A的變異可以影響這種平衡，甚至微弱的變化可以干擾通道亞單位水平的表達。SCN5A的單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性Single nucleotide polymorphisms(SNPs)不僅是遺傳性心律失常綜合征的危險因素，也是獲得性心律失常的危險因素［17-20］。

本研究擬通過對62例LVNC患者的SCN5A變異分析，了解編碼離子通道基因變異對LVNC病理生理相關的心律失常及重癥病例心力衰竭影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

全部病例均來自亞洲，共62例，其中包括17例家族病例及45例散發病例;男30例，女32例，年齡0～69歲。在明確基因型之前，首先對先證者及其相關的家族成員進行查體及攝胸部正側位X線片、心電圖檢查，并應用二維及彩色多普勒心臟超聲來評價心臟結構，左心室大小、功能(短軸縮短率、射血分數)和瓣膜反流的情況。本組病例從二維超聲心動圖可以清晰地看到由肌小梁及深深的小梁間隙構成的致密化不全層及其外部的致密層;彩色多普勒超聲心動圖顯示左心室內的小梁間隙中持續有血流入(圖1)。

圖1 二維超聲心動圖(A)及彩色多普勒超聲心動圖(B)Fig 1 Two-dimensional echocardiography(A)and color Doppler echocardiogrophy(B)

1.2 臨床輔助檢查及診斷依據

1.2.1 心臟超聲 (1)肥大的左心室內至少有一側壁的心內膜心肌密布肌小梁;(2)左心室收縮功能降低;(3)心內膜的致密化不全層與致密層厚度之比大于2.0;(4)從彩色多普勒上可以看到肌小梁間隱窩與左室有血流相通。

1.2.2 心電圖 應用12導聯同步心電圖及動態心電圖確診［4］。

1.2.3 心力衰竭 根據Ross 1992年嬰兒心衰診斷標準以及2001年Connolly等提出的小兒慢性心衰嚴重程度評分分級的新方法［21-22］。

1.3 分子遺傳學研究

在簽署知情同意書后，采外周靜脈血，提取DNA(試劑盒Qiagen:Valencia，CA)并立即建立細胞系。

應用PCR方法對每名先證者的SCN5A基因進行擴增。根據NCBI及Celera數據庫中的基因序列，運用在線程序Primer 3設計每段編碼外顯子及其側翼內含子序列的PCR引物，PCR的具體方法詳見文獻［6］。在實驗中，根據需要來調整PCR的引物序列及條件。將PCR擴增后的產物與變性緩沖液一起加熱，進行SSCP 分析［5］。

將正常對照和異常的SSCP條帶從已經干燥的膠片上切割下來純化后，根據Applied Biosystems(ABI)Big Dye Terminator Cycle Sequencing的實驗方案，并應用ABI 310自動基因序列分析儀對樣本進行分析，得出的基因序列與公布在NCBI上的野生型基因序列進行對比。一旦發現變異，將從最原始的基因組DNA開始，重新擴增PCR，并將產物直接進行基因序列分析。

1.4 統計學處理

所有資料應用SPSS 11.5軟件分析。兩組SNP發生率比較采用χ2檢驗。對基因變異與心律失常關系的計算應用邏輯回歸分析(logistic regression)，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 基因序列分析

本研究隊列62例LVNC的先證者，包括45例散發病例(S)和17例家族病例(F)，并對8名相關的家族成員進行基因型-表型關系的分析。先證者性別、確診時年齡、臨床表型及其SCN5A變異情況見表1。

表1 LVNC先征者的臨床及基因序列分析數據Tab 1 Clinical and molecular data for probands with LVNC

續 表

在7例家族病例和12例散發病例中，我們發現了6種雜合子和1種純合子變異(表1、2)。其中rs6599230:G＞A、rs1805124:A ＞G(p.H558R)、rs1805125:C ＞T(p.P1090L)和rs1805126:T＞C已經公布在NCBI SCN5A SNP數據庫，c.453C ＞T、c.1141-3C＞A這2種 SNPs已經有報道［23-24］。本研究中，在合并完全性房室傳導阻滯(AVB)的散發病例 S43的 DNA中，發現了c.3996C＞T變異，未曾有過報道。

表2 本研究中的SCN5A變異Tab 2 SCN5A variants in our study

2.2 臨床資料分析

在34例合并有心力衰竭的先證者中，18例存在SCN5A變異(52.9%)，其中7例為家族病例，11例為散發病例;而28例無心力衰竭的先證者中只有1例有該基因的變異(3.57%)。經卡方檢驗，兩者差異有統計學意義(χ2=15.36，P=0.000 2)。值得注意的是在合并有心力衰竭并且存在SCN5A變異的18例病例中，有17例同時存在多種類型的心律失常，如:房室傳導阻滯(AVB，8例)、心房顫動(AF，2例)、LQTS(2例)、預激綜合征(WPW，5例)、病態竇房結綜合征(SSS，2 例)、室性心動過速(VT，7 例)、室性早搏(PVC，10例)、陣發性室上性心動過速(PSVT，3 例)。見圖2。

換個角度來看，在本研究的全部病例中，有SCN5A變異的19例患者均合并有心律失常，并且18例合并心力衰竭(表2、3)。

表3 LVNC心力衰竭組與無心力衰竭組SCN5A變異率的分析比較Tab 3 Incidence of SCN5A variants in the cases with heart failure and in those without heart failure

圖2 家族病例6患者的臨床資料及基因分析圖Fig 2 The clinical and genetic information of case F6

3 討 論

現已證實，SCN5A的基因變化與心律失常的病理生理及心肌病相關，可以影響抗心律失常藥物的敏感性［7］。一些正常外顯子的SNPs也可以引起鈉通道生理功能的變化［14］。我們在 LVNC患者中發現了DTNA、TAZ和 LDB3這3種基因變異［4-6］。50%以上的LVNC患者合并有心律失常及心力衰竭［25］，本研究結果與之相符。本研究將患者的SCN5A基因序列進行逐一掃描，深入分析離子通道基因變異與心力衰竭的關系。在患者群中，我們鑒定出極有意義的基因變異數字(包括同義的和非同義的核苷酸置換)。而且，在合并有心力衰竭的患者中有著更高的該基因變異率(53%vs4%，P=0.000 2)。因此，這些數據支持編碼離子通道的基因可以潛在地決定LVNC患者預后的觀點。

本研究發現的變異中，H558R堿基置換位于細胞質的Na+通道Ⅰ-Ⅱ干擾區域的鏈接處。以往的功能性研究證實，編碼R558的微小等位基因可以顯著地改變致病性SCN5A變異的表型，可以對其他變異所引起的鈉通道的功能變化進行調節，起到基因內的修復作用。H558R在不同的基因變異背景中對基因功能的影響大不相同，甚至致使“基因缺失”［26］。本研究中2例H558R變異者QT間期是正常的，但是他們均有很嚴重的心律失常(PVC、WPW綜合征)及重度心力衰竭。在合并有AF的散發病例31、合并PVC的家族病例6(先證者)及有SSS(先證者母親)家族病例6的母親中，我們均發現了P1090L變異。P1090位于細胞質的Na+通道Ⅱ-Ⅲ干擾區域的鏈接處，P1090L是一個亞洲人常見的多態現象，在Q1077缺失的情況下，P1090L可以導致一個激活中間點的顯著負面轉換［26］。

除c.3996C＞T之外，其他的變異可在正常人群中發現。不管這些變異是否影響到氨基酸序列，顯著數量的單核苷酸置換可以改變mRNA剪接的效能或精確度［5］。這些剪接改變可以是不完全的，可導致鈉通道表達的細微變化，在病理條件下可以導致心臟的復極化，因此，可以影響潛在LVNC致病性突變的臨床表型，對LVNC患者潛在的病理的基因變異起到修飾作用。據報道［18］，Rs1805126:T＞C與短 QT間期有關。本研究發現，Rs1805126:T＞C與LVNC患者的心律失常及心力衰竭的高風險性相關。

LVNC合并心力衰竭者SCN5A的變異率明顯高于無心衰者，提示心衰發病與該基因有密切的關系。如前所述大多數的SCN5A變異者均與多種形式的心律失常及心力衰竭相關，而且在同一個家族里，可以發現有多種心律失常表現型。例如，嚴重心力衰竭的第6號先證者(圖2)是一位LVNC合并PVC患者，其存在兩種變異，即rs1805126:T＞C和p.P1090L，這兩種變異均來源于其患有LVNC并合并SSS的母親。應用回歸分析，患者帶有rs1805126:T＞C變異的有著明顯增高的心律失常及心力衰竭的風險性［OR=5.69(1.05，30.84)，P=0.044］。心律失常，如多源多形性室早、室速，可繼發室顫甚至猝死，加重心肌缺血，使心臟的血液動力學產生改變，嚴重影響該病的預后。而心室擴張和張力增高可產生早期后除極、有效不應期不均一縮短及復極不均一性。在心肌的缺血及炎性反應等因素作用下，心肌細胞間出現微小纖維化引起傳導延緩、單向阻滯及心率增快并引起心室肌電傳導重構。

綜上所述，對LVNC患者及早進行SCN5A基因分析，應用電生理技術及時發現各種心律失常并予以早期控制，對提高LVNC的治療效果及預后判斷具有重要意義。

由于PCR-SSCP分析的敏感性相對低，本研究所報道的SNPs要低于實際值。此外，在血樣分析的過程中，分析者不了解患者的臨床表現，因此，避免了人為的差異。然而，由于技術及實驗儀器的原因，還存在著一定的假陰性率。因此，進一步的研究期望通過細胞內酸中毒或誘導的鈣超載以獲得更多的新發現。

LVNC合并心律失常的患者中，SCN5A變異的發生率顯著高于沒有合并心律失常的患者，證實了SCN5A的變異可以增加LVNC患者心律失常發生的假設。此外，心律失常發生率提高也增加了心力衰竭的風險。由此，我們推測那些能恢復鈉通道功能的藥物可能為LVNC患者提供新的治療方法。

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