伽馬刀放療腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌對腸道菌群的影響

李榮富，李欣，吳姍珊，高廣周，孫濤

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)海軍臨床學(xué)院，北京 100048;2.中國人民解放軍海軍總醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100048;3.中國人民解放軍海軍總醫(yī)院放療科，北京 100048;4.中國人民解放軍海軍總醫(yī)院中心實驗室，北京 100048)

腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌在臨床上較常見，多由消化系統(tǒng)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移而來，易導(dǎo)致患者腹痛或腰背部疼痛等不適，使患者生活質(zhì)量下降。近年來，γ刀放療已成為腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的主要選擇之一，其止痛效果良好，且能有效殺滅局部腫瘤細(xì)胞。然而，局部γ刀放療是否影響腸道菌群的平衡目前尚不十分清楚。本研究選擇了海軍總醫(yī)院2010年4月至2011年1月間采用γ刀放療的腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌患者作為觀察組，監(jiān)測其腸道菌群變化，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

研究對象為經(jīng)臨床表現(xiàn)及影像學(xué)、病理學(xué)確診的腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌并擬行γ刀放療的40例患者，男24例，女16例，年齡(59.7±15.4)歲。由于不同年齡和性別患者腸道菌群可能有差異，我們選擇與患者年齡、性別相匹配的20例健康志愿者為對照組，男13例，女7例，年齡(55.6±17.8)歲。觀察組及正常對照組人員在入選前6周內(nèi)、放療期間及放療結(jié)束后1個月內(nèi)均未使用過任何抗生素及腸道微生態(tài)制劑，入選前查糞便常規(guī)正常，且無腹瀉、腹脹、便秘等腸道菌群紊亂表現(xiàn)。

1.2 主要儀器和試劑

OUR-QGD型體部γ刀，熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad);標(biāo)準(zhǔn)菌株:長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(源自中國科學(xué)院微生物所菌種保藏中心)，大腸桿菌及糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(源自海軍總醫(yī)院檢驗科微生物室);主要試劑:Taq Plus PCR Master-Mix、Real Master Mix、SYBR solution、TI ANamp Bacteria DNA Kit(北京天根生物技術(shù)公司)。

1.3 放療方法

觀察組40例患者均采用OUR-QGD型體部伽瑪?shù)吨委煛；颊咂脚P于定位床，內(nèi)置負(fù)壓袋，抽真空固定軀體，CT 3～5 mm層距掃描病灶，將獲得的圖像和相關(guān)數(shù)據(jù)輸入治療計劃系統(tǒng)，以55%～70%等劑量包繞計劃靶區(qū);劑量為3.0～4.5 Gy·次－1，放療次數(shù)為10～11次，總放射劑量為30.8～49.5 Gy，前4次為隔日治療，后為連續(xù)治療。

1.4 糞便標(biāo)本采集

觀察組患者留取放療前、放療結(jié)束后1周及1個月清晨糞便，對照組留取清晨糞便1次。每次留取糞便標(biāo)本0.4 g以上，采取無菌玻璃瓶留存;所留取標(biāo)本于2 h內(nèi)放入－80℃低溫冰箱保存待檢。

1.5 細(xì)菌DNA測定

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株及糞便標(biāo)本DNA提取 取標(biāo)準(zhǔn)菌株長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、大腸桿菌、糞腸球菌凍干粉(均為0.2 g)，用TIANamp Bacteria DNA試劑盒提取標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA。取0.2 g糞便標(biāo)本用DNA緩沖液處理后，取上清200 μl同法提取糞便細(xì)菌基因組DNA。提取后的標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA及糞便基因組DNA樣品均于－20℃冰箱保存。

1.5.2 PCR引物設(shè)計 參照Rinttila等［1］報道方法，根據(jù)長雙歧桿菌、酸酸乳桿菌、大腸桿菌、糞腸球菌16S rDNA基因序列設(shè)計雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬、腸球菌屬的菌屬特異PCR引物和大腸桿菌菌種特異PCR引物(表1)，并在BLAST基因庫內(nèi)比對引物序列的特異性。

表1 4種目標(biāo)菌特異性引物Tab 1 Specific primers of four kinds of target species

1.5.3 引物特異性檢測 取1名正常對照者的糞便DNA與4種標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA進行常規(guī)PCR反應(yīng)。以100 bp DNA梯為標(biāo)準(zhǔn)，用1.0%瓊脂糖凝膠分析PCR擴增產(chǎn)物。

1.5.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備、濃度測定及拷貝數(shù)計算 以各標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)CR產(chǎn)物經(jīng)切膠、回收后所得的DNA片段作為熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品，用紫外分光光度計測定其OD值，并記錄由系統(tǒng)計算出的DNA濃度。根據(jù)公式，分別計算每一標(biāo)準(zhǔn)品PCR片段的拷貝數(shù)。

1.5.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 將各標(biāo)準(zhǔn)品作10倍稀釋，使之成為1×107～1×102拷貝·μl－1，作為標(biāo)準(zhǔn)品，進行SYBR Green為熒光染料的實時定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)完畢后進行溶解曲線分析，從60℃開始，直到95℃，以0.5℃間隔逐漸加熱，每一遞增溫度保持10 s以讀取溶解曲線熒光數(shù)據(jù)。根據(jù)讀取的熒光數(shù)據(jù)，由系統(tǒng)軟件 iCycler Optical System Interface Software(v2.0，Bio-Rad)自動分析Ct值，并產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.6 待測糞便樣品 16S rDNA的定量分析，將待測糞便樣品中提取的DNA分別進行4種細(xì)菌的16S rDNA熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線制備時相同。每次實驗同時設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品校正和ddH2O代替DNA模板的陰性對照，每個樣品均同時做3個平行復(fù)孔。反應(yīng)完畢后根據(jù)溶解曲線分析PCR產(chǎn)物的特異性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以±s表示，采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 引物特異性鑒定

用1.0%瓊脂糖凝膠分析各標(biāo)準(zhǔn)菌株及對照者糞便標(biāo)本的16S rDNA常規(guī)PCR擴增產(chǎn)物，以100 bp DNA Ladder為標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果可見4種標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)CR擴增產(chǎn)物均顯示出特異性條帶;正常對照組糞便標(biāo)本DNA擴增產(chǎn)物除目的條帶外，未見明顯非特異性區(qū)帶(如圖1)。提示各菌種引物特異性好，可用于實時熒光定量PCR反應(yīng)。

圖1 16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳圖Fig 1 The electrophoresis of 16S rDNA PCR products

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品基因組DNA濃度的測定

分別測定各標(biāo)本的OD值，并由系統(tǒng)自動計算出雙鏈DNA濃度。每份標(biāo)本均檢測3次，取其平均值。標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA濃度中長雙歧桿菌為55 ng·μl－1，大腸桿菌為 48 ng·μl－1，糞腸球菌為 39 ng·μl－1，酸酸乳桿菌為 46 ng·μl－1。

2.3 擴增曲線

各標(biāo)準(zhǔn)品10倍稀釋后進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，可得到模板循環(huán)數(shù)與熒光強度關(guān)系圖(圖2)。從圖中可以看出不同拷貝數(shù)的模板隨循環(huán)數(shù)的增加，其熒光強度逐漸增加，在經(jīng)過一段指數(shù)擴增期后曲線趨于平行，指數(shù)擴增期模板拷貝數(shù)與熒光累積值的對應(yīng)關(guān)系形成了定量的基礎(chǔ)。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以不同拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品的對數(shù)為縱坐標(biāo)，以定量PCR反應(yīng)過程中達(dá)到熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)(Ct)為橫坐標(biāo)，得到各細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線，為待測樣品的定量提供了參考標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

2.5 溶解曲線

每次定量PCR反應(yīng)完畢后進行溶解曲線分析，可見溶解曲線均為單峰，說明擴增產(chǎn)物單一，與SYBR Green熒光染料結(jié)合的為目的DNA片段，避免了定量PCR檢測過程中假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，溶解曲線見圖4。

圖2 4個目標(biāo)菌群標(biāo)準(zhǔn)品實時熒光定量PCR擴增曲線圖Fig 2 The Real-time PCR amplification curves of four kinds of target bacteria standards

圖3 4個目標(biāo)菌群標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig 3 The standard curve of four kinds of target bacteria

2.6 糞便標(biāo)本的細(xì)菌定量

4種糞便細(xì)菌定量的結(jié)果見表2～5。由表2～5可見，與對照組相比，觀察組患者γ刀放療前及放療后1周糞便中4種腸道目標(biāo)菌群無明顯變化(P＞0.05)，放療后1個月，糞便中大腸桿菌及腸球菌屬細(xì)菌數(shù)量仍無顯著變化(P＞0.05)，但雙歧桿菌屬及乳酸桿菌屬細(xì)菌數(shù)量明顯減少(P＜0.05)。

圖4 4個目標(biāo)菌群溶解曲線圖Fig 4 The dissolution curve of four kinds of target bacteria

表2 γ刀放療前后糞便標(biāo)本大腸桿菌定量結(jié)果(±s) LogN·(g濕便)－1Tab 2 The quantitative results of stool specimens of E.coli( ± s) LogN·(g wet stool)－1

表2 γ刀放療前后糞便標(biāo)本大腸桿菌定量結(jié)果(±s) LogN·(g濕便)－1Tab 2 The quantitative results of stool specimens of E.coli( ± s) LogN·(g wet stool)－1

組 別 n 細(xì)菌定量放療前 放療后1周 放療后1個月正常對照組 20 9.16±1.15— —觀察組 40 9.23 ±0.98 8.99 ±1.13 9.35 ±1.05 t值0.245 －0.535 0.644 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05

表3 γ刀放療前后糞便標(biāo)本腸球菌屬細(xì)菌定量結(jié)果( ±s) LogN·(g 濕便)－1Tab 3 The quantitative results of stool specimens of Enterococcus( ± s) LogN·(g wet stool)－1

表3 γ刀放療前后糞便標(biāo)本腸球菌屬細(xì)菌定量結(jié)果( ±s) LogN·(g 濕便)－1Tab 3 The quantitative results of stool specimens of Enterococcus( ± s) LogN·(g wet stool)－1

組 別 n 細(xì)菌定量放療前 放療后1周 放療后1個月正常對照組 20 8.04±0.86— —觀察組 40 8.19 ±0.84 8.00 ±0.62 8.22 ±0.85 t值0.919 0.185 1.019 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05

表4 γ刀放療前后糞便標(biāo)本雙歧桿菌屬細(xì)菌定量結(jié)果( ±s) LogN·(g 濕便)－1Tab 4 The quantitative results of stool specimens of Bifidobacterium genus( ± s) LogN·(g wet stool)－1

表4 γ刀放療前后糞便標(biāo)本雙歧桿菌屬細(xì)菌定量結(jié)果( ±s) LogN·(g 濕便)－1Tab 4 The quantitative results of stool specimens of Bifidobacterium genus( ± s) LogN·(g wet stool)－1

組 別 n 細(xì)菌定量放療前 放療后1周 放療后1個月正常對照組 20 9.07±0.77— —觀察組 40 9.15 ±0.76 9.13 ±0.91 8.11 ±1.36 t值0.388 0.291 －2.926 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＜0.05

表5 γ刀放療前后糞便標(biāo)本乳酸桿菌屬細(xì)菌定量結(jié)果( ±s) LogN·(g 濕便)－1Tab 5 The quantitative results of stool specimens of Lactobacillus( ± s) LogN·(g wet stool)－1

表5 γ刀放療前后糞便標(biāo)本乳酸桿菌屬細(xì)菌定量結(jié)果( ±s) LogN·(g 濕便)－1Tab 5 The quantitative results of stool specimens of Lactobacillus( ± s) LogN·(g wet stool)－1

組 別 n 細(xì)菌定量放療前 放療后1周 放療后1個月正常對照組 20 8.80±1.01— —觀察組 40 8.71 ±0.94 8.84 ±0.94 7.99 ±1.23 t值 －0.358 0.144 －2.386 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＜0.05

3 討 論

腸道菌群構(gòu)成腸道的生物屏障，它是人體微生態(tài)學(xué)的重要組成部分，也是最大最復(fù)雜的微生態(tài)系。腸道細(xì)菌達(dá)400～500種，總量有1 014個集落形成單位，相當(dāng)于人體體細(xì)胞數(shù)量的10倍［2］。細(xì)菌約占正常成人糞便重量的60%，其中80%由6種主要細(xì)菌組成，包括擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬、梭菌屬、腸球菌屬及腸桿菌屬，每個菌屬均包括許多菌種［3］。糞便標(biāo)本常用于研究結(jié)腸菌群，主要代表遠(yuǎn)端結(jié)腸的腔內(nèi)環(huán)境［4］。隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的迅速發(fā)展，出現(xiàn)了許多非培養(yǎng)依賴的新方法用于檢測腸道菌群，其中基于16S rDNA基因序列分析技術(shù)就是其中較常用的一種方法。

16S rDNA是細(xì)菌染色體上編碼16S rRNA相對應(yīng)的DNA序列，其堿基序列含進化速度不同的可變區(qū)和保守區(qū)。保守區(qū)在進化過程中保持穩(wěn)定，某些序列片段為所有細(xì)菌所共有。根據(jù)數(shù)據(jù)庫中已知的不同細(xì)菌的16S rDNA序列設(shè)計特異性引物，就可應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測樣本中細(xì)菌基因組16S rDNA的拷貝數(shù)。本實驗中所采用的熒光染料為SYBR Green，它可與雙鏈DNA嵌入性結(jié)合，該方法可用性高，操作較為簡便，且費用較低。實時熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加［5］。從而利用熒光強度的積累實時監(jiān)測整個PCR進程，實現(xiàn)對未知模板進行定量的一種方法。對模板進行定量的方法可分為絕對定量和相對定量兩種。絕對定量方法是用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進行PCR反應(yīng)，以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以測得的Ct值作為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，繼而在相同的條件下對未知樣品進行PCR反應(yīng)，測得樣本 Ct，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到樣品的拷貝數(shù)［6］。相對定量是利用一定樣本中的靶序列與另一參照樣本的量的比較，最常見的參照看家基因(又稱管家基因)有 GAPDH、β-actin、18SRNA 和 28SRNA［7］等。本研究采用的是絕對定量方法。

本研究中應(yīng)用以16S rDNA為基礎(chǔ)的實時熒光定量PCR法，對已行γ刀放療患者的腸道菌群進行定時監(jiān)測，結(jié)果顯示，γ刀放療后1個月腸道雙歧桿菌屬及乳酸桿菌屬細(xì)菌數(shù)量較正常對照組明顯減少，而大腸桿菌及腸球菌屬細(xì)菌數(shù)量無明顯變化。γ刀放療結(jié)束后1周患者腸道菌群無明顯變化，放療結(jié)束后1個月腸道內(nèi)大腸桿菌及腸球菌屬細(xì)菌數(shù)量仍無明顯改變，其原因考慮有:(1)體部γ刀放療作為當(dāng)前一種治療晚期惡性腫瘤的手段，與既往普通放療方式不同，作用范圍小，采用旋轉(zhuǎn)野照射，在對正常組織損傷小的同時對腸道菌群影響也較小;(2)γ刀放療作用主要集中于已有癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)，而位于腫瘤周圍腸管不斷蠕動，導(dǎo)致單位腸道面積接受放射劑量小，相應(yīng)腸道上皮細(xì)胞損傷較輕，腸道細(xì)菌定居環(huán)境無明顯受損，同時腸道內(nèi)細(xì)菌直接接受的放射劑量較小，不足以殺滅細(xì)菌;(3)放射線的治療作用在一定程度上主要依靠后效應(yīng)，因此，在放療期間以及放療結(jié)束后1周內(nèi)局部放射線作用發(fā)揮不完全;(4)本研究跟蹤標(biāo)本時間較短，僅1個月，腸道內(nèi)大腸桿菌及腸球菌屬細(xì)菌數(shù)量是否會在1個月后上升仍需進一步研究。γ刀放療結(jié)束1個月后，腸道內(nèi)益生菌數(shù)量明顯減少，考慮為γ刀放療遠(yuǎn)后效應(yīng)使腸道菌群定居生存環(huán)境發(fā)生改變及直接殺死腸道益生菌所致;而大腸桿菌及腸球菌數(shù)量無明顯變化，考慮為一方面放療遠(yuǎn)后效應(yīng)直接或間接殺死部分大腸桿菌及腸球菌屬細(xì)菌，另一方面為腸道益生菌數(shù)量減少，有利于大腸桿菌及腸球菌屬細(xì)菌數(shù)量的增長，造成消減與增長互相抵消。放射線導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)機制［8］為:(1)放射線損傷宿主的腸上皮細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)，從而使腸道原籍菌如雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌不能穩(wěn)定定居于上皮細(xì)胞表面或黏蛋白層上。(2)放射線直接殺滅、抑制、擾亂腸道正常菌群;(3)放射性腸炎患者腸蠕動減慢、淤滯、微絨毛受損，導(dǎo)致腸道清除能力下降，繼而導(dǎo)致菌群紊亂。腸道益生菌具有直接抗致病微生物作用:主要通過降低腸道定植、抑制致病菌與腸道上皮細(xì)胞結(jié)合、抑制致病菌侵入腸上皮細(xì)胞、促進腸上皮細(xì)胞分泌β防御素及促進腸道sIgA的分泌［9］而產(chǎn)生。乳酸桿菌屬及雙歧桿菌屬細(xì)菌等原籍菌減少可使腸道通透性明顯增高，而小腸通透性增高使水、鈉吸收減少產(chǎn)生腹瀉;另一方面可使腸黏膜免疫系統(tǒng)過多暴露于腸腔內(nèi)的抗原而活化，使肥大細(xì)胞數(shù)目增多、細(xì)胞因子水平升高，而后兩者對胃腸道動力和分泌功能均有影響。菌群失調(diào)可能導(dǎo)致結(jié)腸內(nèi)食物殘渣酵解異常，從而使酵解產(chǎn)物包括短鏈脂肪酸、其他有機酸、乙醇、二氧化碳和甲烷的量發(fā)生變化，引起腹脹、腹痛等癥狀［10］，提高了腸源性感染的風(fēng)險。根據(jù)既往報道［11］，放療后腸腔內(nèi)大腸桿菌及腸球菌屬細(xì)菌數(shù)量增加。

本觀察結(jié)果提示，γ刀放療期間及放療結(jié)束后1周內(nèi)患者腸道菌群較穩(wěn)定，因此，在γ刀放療期間及放療結(jié)束后1周內(nèi)無需過多干預(yù)調(diào)節(jié)腸道菌群。而在γ刀放療結(jié)束后1個月內(nèi)即可出現(xiàn)腸道益生菌如雙歧桿菌屬及乳酸桿菌屬細(xì)菌數(shù)量減少，出現(xiàn)輕微的腸道菌群紊亂。由于放療通過損傷腸黏膜屏障和改變腸內(nèi)環(huán)境，使腸道內(nèi)革蘭陰性菌優(yōu)勢繁殖，益生菌數(shù)量減少，發(fā)生菌群失調(diào)。與此同時，細(xì)菌內(nèi)毒素可經(jīng)門靜脈大量進入體循環(huán)而形成腸源性內(nèi)毒素血癥。內(nèi)毒素血癥反過來又可使胃腸功能紊亂、肌張力下降、腸蠕動減弱、毛細(xì)血管通透性增加，導(dǎo)致大量炎性物質(zhì)滲出，從而加重腸黏膜的損傷程度，進一步加劇腸道細(xì)菌移位和內(nèi)毒素吸收，形成惡性循環(huán)［12］。因此，預(yù)防治療γ刀放療患者出現(xiàn)的腸道菌群紊亂至關(guān)重要。然而，由于放療的遠(yuǎn)后效應(yīng)，關(guān)于使用腸道微生態(tài)制劑能否有效調(diào)劑腸道菌群，何時使用腸道微生態(tài)制劑以及使用何種腸道微生態(tài)制劑調(diào)節(jié)腸道菌群最為有效仍需進一步研究。

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