斷奶應激對仔豬腸形態、腸黏膜屏障和p38絲裂原活化蛋白激酶信號通路的影響

欒兆雙 姚麗麗 傅振寧 宋 娟 胡彩虹

(浙江大學飼料科學研究所，動物分子營養學教育部重點實驗室，杭州 310058)

早期斷奶造成仔豬營養、環境和心理應激，增加斷奶后仔豬對環境潛在病原微生物的敏感性，使仔豬食欲差、消化不良、腹瀉、生長受阻、死亡等，給養豬業帶來較大經濟損失。腸道是機體十分重要的防御屏障，仔豬消化道組織和功能發育尚未成熟，斷奶應激導致的生理、營養和環境狀況的突然改變易造成其腸道功能紊亂［1］。大量研究表明，斷奶應激狀態下仔豬腸形態受損，消化吸收能力下降［2－3］。然而關于早期斷奶引起仔豬腸黏膜屏障變化的報道還較少，對于斷奶應激引起仔豬腸道損傷的信號轉導機制尚不清楚［4］。

腸道損傷所涉及的缺血、炎癥、凋亡等多個病理機制與絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號道路的調節有關。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)是 MAPKs家族成員之一，p38 MAPK屬于應激活化蛋白激酶，可被促炎因子(如腫瘤壞死因子－α、白細胞介素－1)、應激刺激(如紫外線、H2O2、熱休克、高滲、蛋白質合成抑制劑等)以及脂多糖激活。p38 MAPK信號通路參與介導細胞的增殖和分化、細胞的凋亡和死亡等生理病理過程，并與炎癥調控反應機制密切相關［5－6］。p38 MAPK 是否參與斷奶應激引起的仔豬腸道損傷的信號轉導目前尚未見報道。本文研究了早期斷奶對仔豬腸黏膜屏障的影響，同時檢測結腸黏膜p38 MAPK磷酸化的活化情況，為預防仔豬早期斷奶應激提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設計

試驗選取體況相似、胎次和預產期接近的同品種母豬12窩，產仔數為9～11頭。仔豬均為“杜×長×大”三元雜交品種。仔豬從7日齡開始誘食并哺乳。在21日齡，每窩選取2～3頭仔豬［平均體重為(5.8±0.4)kg］斷奶后在保育舍飼養，為斷奶組，每窩剩下的仔豬不斷奶繼續哺乳至35日齡，為哺乳組。仔豬自由采食和飲水，按常規程序進行免疫，試驗期為14d。分別于仔豬22、24、28和35日齡屠宰取樣，每次每組6頭。哺乳組和斷奶組在相同的間隔時間取樣。

1.2 基礎飼糧

基礎飼糧參照美國NRC(1998)斷奶仔豬的營養需要配制成顆粒飼料。基礎飼糧組成及營養水平見表1。

1.3 樣品采集與測定

分別于22、24、28和35日齡，仔豬前腔靜脈取血，肝素抗凝，制備血漿，－80℃保存。然后屠宰仔豬取樣，剖開腹腔，取長度約1 cm的空腸腸段，用生理鹽水將其輕輕沖洗干凈，而后平鋪在濾紙上將液體吸干，浸入10%的福爾馬林中，置4℃冰箱保存，待做組織切片，光鏡分析其形態結構的變化。另取10 cm左右結腸腸段用剪刀剖開，生理鹽水輕輕沖洗腸內容物，濾紙吸干水分，再用手術刀鈍面輕輕刮取腸黏膜，分裝在5 mL無菌凍存管中，液氮速凍，－80℃保存。

1.3.1 腸形態分析

用一系列濃度梯度的乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片，蘇木精－伊紅(HE)染色，中性樹膠封片。Leica Qwin圖像分析儀對空腸絨毛高度和隱窩深度作定量分析。

1.3.2 血漿D－乳酸含量、二胺氧化酶活性測定

血漿D－乳酸含量測定參照Brandt等［7］建立的分光光度法。血漿二胺氧化酶活性分析參照胡泉舟等［8］的方法，用分光光度法測定。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basaldiet(DM basis) %

1.3.3 結腸黏膜p38 MAPK的活化情況測定

參考Costantini等［5］的方法。全細胞裂解液提取結腸黏膜蛋白，BCA法定量蛋白濃度。取100 μg樣品加樣后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含5%脫脂乳粉的0.06%Tween-20的三羥甲基氨基甲烷溶液(TBST)封閉40 min后洗膜，加入相應抗體(1∶1 000)4℃過夜孵育，將膜漂洗后加入兔抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)抗體(1∶1 000)于室溫孵育1 h，最后加入化學發光(ECL)試劑暗室曝光底片。底片掃描后進行蛋白條帶的光密度值分析。BCA蛋白定量試劑盒為Thermo公司產品;全細胞裂解液、兔抗小鼠磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)和p38 MAPK單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司;辣根過氧化物酶標記β－肌動蛋白(β-actin)的兔抗小鼠IgG抗體購自美國Sigma公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體、ECL試劑盒為美國Santa Cruz公司產品。p38 MAPK信號通路的激活狀況以其磷酸化水平與總水平的比值(p-p38 MAPK/p38 MAPK)來表示，結果以哺乳組22日齡仔豬p-p38 MAPK/p38 MAPK為參照，斷奶各組p-p38 MAPK/p38 MAPK為相對于哺乳組22日齡仔豬比值的倍數。

1.4 數據統計

數據以平均值±標準差表示，采用SAS 6.12中的一般線性模式(GLM)進行統計分析，Duncan氏法進行多重比較檢驗，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

（2）80和100℃條件下和磺化鉆井液相比較，HTHP失水相差不大，但在120℃高溫條件下HTHP失水相對偏高，高溫能力不如磺化處理劑；

2 結果

2.1 斷奶應激對仔豬空腸形態的影響

由表2可見，與哺乳組相比，斷奶組空腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度在22、24和28日齡均顯著降低(P＜0.05)，隱窩深度均顯著提高(P＜0.05)，35日齡上述指標斷奶組與哺乳組差異不顯著(P＞0.05)。斷奶組在斷奶后的不同時間腸形態也發生了變化，斷奶仔豬24和28日齡空腸絨毛高度/隱窩深度顯著低于22日齡(P＜0.05)，隱窩深度顯著高于22日齡(P＜0.05);35日齡斷奶仔豬空腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度顯著高于22、24和28日齡(P ＜0.05)。結果表明，21日齡斷奶使仔豬的腸形態發生了較大的變化，斷奶后24 h就引起了仔豬腸絨毛萎縮、隱窩增深，28日齡后逐漸恢復，至35日齡腸形態基本恢復。

表2 斷奶應激對仔豬空腸形態的影響Table 2 Effects of weaning stress on jejunal morphology of piglets

2.2 斷奶應激對仔豬腸黏膜通透性的影響

由表3可見，與哺乳組相比，斷奶組血漿D－乳酸含量和二胺氧化酶活性在斷奶后不同時間均顯著提高(P＜0.05)。斷奶組在斷奶后的不同時間腸黏膜通透性也發生了變化，斷奶仔豬22、24和28日齡血漿D－乳酸含量和二胺氧化酶活性依次提高(P＜0.05)，至35日齡血漿D－乳酸含量和二胺氧化酶活性雖不再提高，但是仍顯著高于哺乳組(P ＜0.05)。

2.3 斷奶應激對仔豬p38 MAPK信號通路的激活

由表4可見，與22日齡斷奶仔豬相比，24日齡p-p38 MAPK/p38 MAPK顯著增加(P＜0.05)，并達到高峰，隨后此比值隨著日齡的延長逐漸降低。

表3 斷奶應激對仔豬血漿D－乳酸含量和二胺氧化酶活性的影響Table 3 Effects of weaning stress on plasma D-lactate content anddiamine oxidase activity of piglets

表4 斷奶應激對p38 MAPK信號通路的影響Table 4 Effects of weaning stress on p38 MAPK signal pathway of piglets

3 討論

胃腸道是養分消化吸收的主要場所。小腸是消化道內營養物質吸收和轉運的主要部位，吸收是小腸絨毛的主要功能，隱窩則具有分泌能力，仔豬小腸黏膜結構的良好狀態是養分消化吸收和正常生長的生理學基礎。常用小腸腸絨毛高度降低與升高、隱窩深度增加與減少、絨毛高度與隱窩深度比值大小作為評價仔豬發育和營養水平等的重要指標［9］。已有研究報道，斷奶后仔豬腸絨毛萎縮、脫落，隱窩增生，腸道通透性增加［2－3，10］。本試驗證實了前人結果。斷奶后仔豬空腸形態結構的變化可造成仔豬腸道消化吸收面積減少，消化能力下降，大量未消化物質堆積極易引起異常發酵，造成腹瀉，最終影響仔豬的生長。本試驗還發現，21日齡斷奶后仔豬腸形態在1周后逐漸恢復，至35日齡腸形態基本恢復。

二胺氧化酶是哺乳動物腸絨毛上皮細胞的標記酶，其活性與絨毛高度和黏膜細胞的核酸和蛋白合成密切相關。生理情況下血漿中二胺氧化酶活性很低，在腸黏膜受損時，由腸黏膜釋放入血的二胺氧化酶使血中含量上升，因此，外周血中二胺氧化酶活性能反映腸上皮細胞的完整性，可作為反映腸黏膜屏障功能損傷的理想指標［8，11］。D－乳酸是胃腸道固有細菌的代謝終產物，哺乳動物體內不具備將其快速代謝分解的酶系統，當腸黏膜生物屏障被破壞時，腸道中細菌產生的大量D－乳酸透過受損的腸黏膜進入血液循環，故血漿D－乳酸水平可及時反映腸黏膜損傷的程度和通透性變化［7］。本試驗結果表明，與哺乳組相比，斷奶組血漿D－乳酸含量和二胺氧化酶活性在斷奶后不同時間均顯著提高，說明斷奶應激引起仔豬腸黏膜屏障受損，腸道通透性增加。本試驗還發現，斷奶仔豬35日齡血漿D－乳酸含量和二胺氧化酶活性仍顯著高于哺乳組，而仔豬斷奶后造成的腸形態損傷在35日齡基本恢復，說明腸道形態學上的恢復并未使腸上皮的內在結構和功能得到恢復，腸屏障功能的恢復滯后于腸形態的重建。常建星等［12］用大鼠失血性休克模型，研究了休克復蘇后腸通透性與形態學改變的相關性，也發現應激狀態下腸屏障嚴重受損，其通透性的恢復明顯滯后于形態學重建。Prasad等［13］認為，腸形態的恢復只是腸上皮細胞重新生長，覆蓋了腸絨毛表面，但正常的功能并未建立，重建的上皮細胞并未達到完全成熟，重建后的黏膜表面細胞所具有物質轉運屬性和超微結構特點不同于未損傷的上皮組織。腸黏膜細胞最初開始修復階段僅僅是其細胞結構的建立，或者只是恢復了腸上皮細胞的連續性，其功能尚未開始恢復，而最終的修復不但要求新增殖的細胞代替損傷的黏膜細胞，而且還需要細胞外基質的改造及深部細胞恢復正常結構和功能［14－15］。

從細胞表面信號到基因表達所引起的生物學效應過程由多條信號轉導途徑介導，對于斷奶應激引起仔豬腸屏障損傷的信號轉導機制尚不清楚［4］。在多種情況下，蛋白磷酸化是信號傳遞至終端的重要方式，轉錄因子或與其相互作用的上游蛋白常常是磷酸化修飾的直接作用靶點。研究發現，腸道損傷所涉及的缺血、炎癥、凋亡等多個病理機制與MAPKs信號道路的調節有關。p38 MAPK是MAPKs的重要成員之一。已證實p38 MAPK通路在腸損傷時被激活，磷酸化水平增加。p38 MAPK通路被激活后，通過磷酸化其底物，直接或間接影響多種轉錄因子的活性，進一步調節多種炎性細胞因子的基因表達，調控炎癥反應和細胞凋亡，還能激活細胞內一些蛋白激酶，介導細胞骨架重構以及促進腸損傷后上皮細胞存活、增殖和修復過程［5－6］。另有研究發現，p38 MAPK 通路是腸道上皮細胞分化的關鍵調控因素。Broom等報道［16］，炎癥性腸疾病引起胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)、p38 MAPK 被激活，MAPKs激活時間、程度與腸損傷時間、程度一致。本研究發現，斷奶應激顯著增加了p-p38 MAPK/p38 MAPK，激活了p38 MAPK信號通路。

4 結論

①21日齡仔豬斷奶后腸形態和腸黏膜屏障受損，雖然仔豬在35日齡腸形態基本恢復，但是腸道通透性仍未恢復，說明仔豬斷奶后腸道通透性的恢復滯后于形態學重建。

②斷奶應激激活了p38 MAPK信號通路。

感謝美國North Carolina State University獸醫學院Moeser博士對本研究選題、構思和論文撰寫給予的指導。

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