奶牛αs－酪蛋白多克隆抗體的制備、純化及鑒定

龐學燕 季 昀 王洪榮 魏宗友 王夢芝

(揚州大學動物科學與技術學院，揚州 2 25009)

近年來，人們對乳品質的要求越來越高，乳蛋白作為衡量乳品質的重要指標，其合成的營養調控已成為奶牛營養學研究的熱點。乳蛋白大部分是由奶牛乳腺上皮細胞從頭合成和分泌的，80%的乳蛋白由酪蛋白組成，而牛乳中的酪蛋白主要由 αs－ 酪蛋白(αs－casein)組成(45% ～ 55%)［1］，因此研究調控αs－酪蛋白的合成具有重要意義。目前，檢測牛乳或乳腺細胞合成分泌的酪蛋白最常用的方法主要包括酶聯免疫(ELISA)法和免疫印跡(Western－blot)法，而這2種方法均需用到酪蛋白抗體，目前沒有商品化的奶牛αs－酪蛋白抗體，因此本試驗通過免疫新西蘭兔來制備兔抗牛αs－酪蛋白多克隆抗體，旨在為研究奶牛αs－酪蛋白合成的調控提供有效的試驗材料。為得到純度較高、特異性較強的抗體，本試驗通過飽和硫酸銨法和蛋白A樹脂對抗血清進行2次純化，純化后得到的抗體用Western－blot法鑒定其與 αs－酪蛋白純品及乳腺組織中αs－酪蛋白的有無特異性反應。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料包括αs－酪蛋白標準品(美國Sigma公司，純度≥70%)、弗氏完全佐劑(美國Sigma公司)、弗氏不完全佐劑(美國Sigma公司)、蛋白A樹脂(美國Genscript公司)、羊抗兔辣根過氧化物酶標記的免疫球蛋白G(IgG－HRP)(武漢博士德公司)、豬源明膠(美國Amresco公司)、二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑(上海生工生物工程公司)、放射免疫沉淀測定(RIPA)裂解液(上海碧云天公司)、2，2－聯喹啉 －4，4－二甲酸二鈉(BCA)蛋白質濃度測定試劑盒(上海碧云天公司)。

1.2 試驗動物及飼養

試驗動物選用4只健康純種新西蘭大白兔(購自南京金陵種兔廠)，飼養前對兔舍進行徹底清掃和消毒，采用單籠飼養，每日飼喂顆粒飼料(飼料中不含酪蛋白)3次，自由飲水。待兔適應飼養環境約1周后，耳緣靜脈采血約1 mL，采用ELISA法測試其血清是否與αs－酪蛋白有反應性，無反應性的合格兔子按免疫程序進行免疫。

1.3 免疫程序

免疫程序見表1，每次免疫前將弗氏佐劑與αs－酪蛋白溶液按1∶1徹底混合乳化后，采用皮下多點注射法，每只兔注射1 mL乳化液(含800 μg αs－酪蛋白)。免疫結束后的第5～7天耳緣靜脈采血，參考楊苗等［2］的ELISA法檢測抗血清效價，效價達到1∶10 000時立即準備放血。

表1 αs－酪蛋白免疫程序Table 1 Immunizing schedule of αs－casein

1.4 抗血清的制備

放血采用頸動脈放血法，用1%戊巴比妥鈉經兔耳緣靜脈緩慢注射麻醉，使兔仰臥并固定，分離兩側頸總動脈，插管放血，待血凝結后，于3 000 r/min離心10 min，取上清分裝后置－80℃冰箱中保存備用。

1.5 飽和硫酸銨純化

飽和硫酸銨純化參考張和平等［3］的方法，略有改動。取500 μL血清加入等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mol/L，pH 7.4)，冰浴下逐滴加入250 μL飽和硫酸銨溶液，旋渦混勻，4℃靜置30 min，4 ℃、4 000 r/min 離心 15 min，取上清液。在上清液中逐滴加入1 000 μL飽和硫酸銨溶液，旋渦混勻，4℃靜置30 min，離心棄上清。沉淀用500 μL PBS溶解，在溶液中逐滴加入250 μL 飽和硫酸銨溶液，邊加邊攪拌，4℃靜置30 min，4℃離心，保留沉淀。沉淀繼續用PBS溶解，滴加飽和硫酸銨溶液，靜置，離心，保留沉淀。將沉淀溶于PBS中，裝入透析袋中4℃透析過夜。

1.6 蛋白A樹脂純化

向純化柱中加入1 mL結合/洗滌緩沖液，將1 mL混勻的蛋白A樹脂加入柱中，再向柱中加入5 mL結合/洗滌緩沖液以平衡柱子，流速約1 mL/min。將結合/洗滌緩沖液稀釋后血清樣本加入柱中，保持流出速度約為1 mL/min。用30 mL結合/洗滌緩沖液沖洗柱子并使緩沖液流出速度約2 mL/min，用15 mL洗脫緩沖液洗脫抗體，保持洗脫液流速約1 mL/min。將含有抗體的洗脫液收集到含平衡緩沖液的燒杯中以中和洗脫液pH至7.4。洗脫出來的抗體溶液裝入透析袋中4℃透析過夜。

1.7 十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)鑒定純化后抗體純度

配制12%的分離膠和5%的濃縮膠，取80 μL抗體樣品與20 μL 5×上樣緩沖液混勻，在沸水中煮沸5 min。每孔上樣12 μL，電壓調為80 V開始電泳，當指示染料進入分離膠后，將電壓調至120 V，繼續電泳直至染料抵達距分離膠下端約1 cm處停止電泳，固定液固定，考馬斯亮藍染色，脫色液脫色，直至條帶清晰可辨，用凝膠成像系統拍照觀察。

1.8 ELISA法檢測純化后抗體的效價

將 αs－酪蛋白標準品用包被液稀釋至20 μg/mL，每孔 100 μL 包被酶標板過夜，并用PBS做陰性對照，用磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗滌3次，每次靜置5 min后迅速傾去洗滌液。每孔中加入200 μL封閉液(1%豬源明膠)，置37℃恒溫箱1 h，洗滌，傾去液體。取不同稀釋度的純化后的抗體(1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400和1∶12 800)，每個稀釋度5個重復，37℃溫育1 h，然后傾去液體，PBST洗滌，傾去液體。每孔加100 μL 按 1∶5 000 稀釋的羊抗兔 IgG－HRP 抗體，37℃溫育1 h，PBST反復洗滌，傾去液體。每孔加入100 μL底物溶液室溫孵育15 min。每孔加入 100 μL 硫酸(H2SO4，2 mol/L)，5 min 后在酶標儀上測定450 nm下的吸光度值。

1.9 Western－blot法鑒定純化后抗體特異性

1.9.1 純化后抗體與αs－酪蛋白純品反應性鑒定

配制12%的分離膠和5%的濃縮膠對αs－酪蛋白溶液進行SAS－PADE，電泳結束后，根據預染蛋白質分子質量標準指示進行切膠，然后將蛋白質轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(60 V恒壓2 h)。用3%豬源明膠室溫封閉1.5 h，然后將抗體溶液按1∶1 600稀釋后，室溫孵育1.5 h，PBST洗膜，用羊抗兔IgG－HRP(1∶5 000稀釋)室溫孵育1.5 h，PBST洗膜，DAB顯色劑顯色，掃描觀察結果。

1.9.2 純化后抗體與奶牛乳腺組織αs－酪蛋白反應性鑒定

將從屠宰場采集的鮮活奶牛乳腺組織剪成細小碎片于－80℃凍存。鑒定時取出凍存的組織加液氮研磨并用RIPA裂解液將其充分裂解后，14 000×g離心5 min，移取上清液，用BCA法測定蛋白質濃度，SAS－PADE電泳，轉膜，1抗、2抗雜交，DAB顯色觀察(詳細條件同1.9.1)。

2 結果

2.1 αs－酪蛋白抗體純度

SDS－PAGE結果(圖1)顯示，經過飽和硫酸銨法和蛋白A樹脂2步純化后得到的αs－酪蛋白抗體重鏈清晰可見，表明通過純化得到了純度較高的αs－酪蛋白抗體。

M:蛋白質分子質量標準 Protein molecular weight marker，1 ～4:αs－ 酪蛋白抗體 Antibody against αs－casein。圖1 SDS－PAGE鑒定αs－酪蛋白抗體純度Fig.1 Identification of purity of antibody against αs－casein by SDS－PAGE

2.2 αs－酪蛋白抗體效價

經過純化以后，ELISA法檢測抗體的效價為1∶1 600。

2.3 αs－酪蛋白抗體特異性

Western－blot結果(圖 2)顯示，純化后的抗體能夠與αs－酪蛋白標準品專一性結合，表明得到的抗體能夠特異性識別αs－酪蛋白。

圖2 Western－blot法鑒定αs－酪蛋白抗體特異性Fig.2 Identification of specificity of antibody againstαs－casein by the method of Western－blot

Western－blot結果(圖 3)顯示，純化后的抗體與奶牛乳腺組織中提取的αs－酪蛋白具有反應性，表明得到的抗體可以用于特異性檢測奶牛乳腺組織αs－酪蛋白的含量。

圖3 Western－blot法鑒定抗體與奶牛乳腺組織中提取的αs－酪蛋白的反應性Fig.3 Identification of reactivity of antibody against αs－casein extracted from bovine mammary gland tissues by the method of Western－blot

3 討論

與制備抗體相比，制備抗血清無需進行純化相對容易，國內學者李震等［4］、張濤等［5－6］相繼成功制備了兔抗牛β－酪蛋白、αs－酪蛋白和κ－酪蛋白的抗血清，但由于未經純化的抗體純度不高，其他物質可能影響到抗體與抗原的作用，因此有必要對抗體進行純化。常見的抗體純化的有效方法包括離子交換層析法、鹽析法和親和層析法。離子交換層析法是利用蛋白質與離子交換樹脂的選擇性結合來達到分離純化蛋白質的目的［7］，Majidi等［8］利用 DEAE－Sepharose Fast Flow 柱進行離子交換層析得到了高純度的兔抗牛IgG。鹽析法主要是利用蛋白質在高濃度鹽溶液中聚集形成沉淀的原理來進行純化的［7］，宋宏新等［9］用飽和硫酸銨分級沉淀法純化了兔抗牛β－酪蛋白多克隆抗體，張和平等［3］對飽和硫酸銨法純化血清中免疫球蛋白的條件進行了優化。飽和硫酸銨法具有方便、廉價、高效等優點，但該法純化后的抗體純度為75%～80%，而親和層析法的純化后的抗體純度高達90%以上，該法是利用蛋白質與介質中的配基特異性結合的原理來分離純化蛋白質的［7］，蛋白A和蛋白G樹脂是從細菌細胞壁中得到的能夠特異性結合免疫球蛋白的介質，能夠有效地分離提純哺乳動物的多克隆抗體［10］，楊苗等［2］用蛋白G樹脂成功純化了兔抗牛β－酪蛋白多克隆抗體，Vítková 等［11］用蛋白 A 樹脂純化了兔源多克隆抗體，并成功用于乳中α－酪蛋白、β－酪蛋白和κ－酪蛋白的檢測。盡管蛋白A和蛋白G樹脂純化多克隆抗體得到的免疫球蛋白純度較高，但這種樹脂價格昂貴，而且多次反復使用后與免疫球蛋白的結合活性降低，基于此，為了提高蛋白A樹脂的使用壽命，本試驗先用飽和硫酸銨對抗體進行粗提純后再用蛋白A樹脂進行親和層析純化，最終得到了純度較高的抗體，而且能夠特異性與αs－酪蛋白發生抗原抗體結合反應，并成功用于鑒定奶牛乳腺組織中 αs－酪蛋白的合成。

隨著動物營養學的發展，以組織、細胞為模型研究營養調控機理已逐漸成為熱點，蛋白質和肽作為細胞內基因表達的產物，用免疫學方法鑒定這些產物常常要用到抗體，而商品化的抗體種類的不足往往難以滿足所有科研的需求，因此，有必要建立一套系統、可靠的實驗室制備抗體的方法來滿足鑒定蛋白質、肽的需要。本試驗成功制備了高純度和特異性的兔抗牛αs－酪蛋白多克隆抗體，為進一步研究通過營養素調控奶牛αs－酪蛋白的合成提供了有效的試驗材料。

4 結論

本試驗通過免疫新西蘭大白兔成功制備了純度較高、特異性較強的兔抗牛αs－酪蛋白抗體，可以用于鑒定奶牛乳腺合成的αs－酪蛋白，為后續奶牛αs－酪蛋白合成調控的研究工作的開展奠定了基礎。

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