卡托普利對(duì)心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響*

王艷飛,王紅英,曹雪濱△,任 越,張 剛,何建成,胡元會(huì)

(1.解放軍二五二醫(yī)院,河北 保定 071000;2.保定市第五醫(yī)院,河北保定 071001;3.上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,上海 201203;4.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院,北京 100053)

細(xì)胞凋亡(apoptosis)是細(xì)胞死亡的一種重要形式,即程序性細(xì)胞死亡。自1972年Kerr等首次提出細(xì)胞凋亡以來(lái),凋亡一直是醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)。凋亡使工作心肌細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量減少,而導(dǎo)致心肌收縮力下降。越來(lái)越多的研究結(jié)果表明細(xì)胞凋亡與慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[1,2]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin-conveting enzyme inhibitor,ACEI)主要針對(duì)神經(jīng)-體液反應(yīng),可改善癥狀,降低死亡率。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立壓力超負(fù)荷心衰大鼠模型,經(jīng)ACEI類(lèi)藥物卡托普利治療后,觀察其對(duì)心衰大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響,進(jìn)一步研究卡托普利治療慢性壓力超負(fù)荷心衰的可能機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與實(shí)驗(yàn)藥品

流式細(xì)胞儀(EPICS-XLⅡ,美國(guó)Beckman Coulter公司);Bax單克隆抗體(克隆號(hào)B-9,編號(hào)I1004);Bcl-2單克隆抗體(克隆號(hào)C-2,編號(hào)G3106);均為美國(guó)Santa-Cruz公司產(chǎn)品。卡托普利:25 mg/tablet,批號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H32023731(江蘇省常州制藥廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠(清潔級(jí)Ⅱ),雄性,體重(200±25)g,90只,由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):SCXK(京)2003-1-003,合格證編號(hào):610119。

1.3 動(dòng)物模型分組、制備及給藥方法

分組:隨機(jī)將90只大鼠分為3組(n=30):假手術(shù)組(SH)、腹主動(dòng)脈縮窄組(CAA)、卡托普利治療組(CAP)。動(dòng)物模型制備[3]:10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉。經(jīng)左脊肋角區(qū)入路,結(jié)扎腹主動(dòng)脈縮窄50%～60%。假手術(shù)組:腹主動(dòng)脈下穿線后打一松結(jié)。給藥方法:SH組及CAA組給予生理鹽水4 ml灌胃,CAP組給予卡托普利 10 mg/(kg·d),加生理鹽水至4ml后灌胃。4周后大鼠逐漸出現(xiàn)呼吸、心跳加快,紫紺,皮下水腫癥狀,提示模型成功。6周后分別取10只大鼠作為研究對(duì)象。10周后,SH組、CAA組、CAP組各死亡10、8、8只,均以剩余大鼠作為研究對(duì)象。

1.4 Bax、Bcl-2的檢測(cè)

切取心尖部組織0.3 g,放于120目不銹鋼網(wǎng)上,將組織剪碎至1mm3大小,邊揉搓邊以PBS緩沖液沖洗。濾去細(xì)胞團(tuán)塊,收集細(xì)胞懸液離心保留沉淀,加入PBS緩沖液0.3 ml,稀釋混勻后分成2份,調(diào)整每份細(xì)胞數(shù)為1×106cells/ml,用于檢測(cè)心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白。分別取單細(xì)胞懸液1ml,分別加入0.1 ml工作液濃度的 Bcl-2、Bax單克隆抗體混勻,室溫孵育30 min。加入PBS緩沖液10 ml混勻后離心棄上清。Bcl-2、Bax加入羊抗鼠FITC-IgG二抗工作液0.1 ml,室溫孵育30 min避光。加入10 ml PBS緩沖液混勻后離心棄上清。加入PBS緩沖液0.1 ml,經(jīng)500目銅網(wǎng)過(guò)濾后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè),結(jié)果用平均熒光強(qiáng)度表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠左心室內(nèi)壓上升、下降的最大變化速率比較

CAA組大鼠10周時(shí)收縮期左心室內(nèi)壓上升、下降的最大變化速率(±dp/dtmax)較6周時(shí)顯著下降(P＜0.01),證實(shí)心衰大鼠心功能呈惡化趨勢(shì)。CAP組大鼠10周時(shí)與6周時(shí)比較-dp/dtmax升高(P＜0.05),+dp/dtmax顯著升高(P＜0.01)。提示隨治療時(shí)間延長(zhǎng),CAP組大鼠心功能得到進(jìn)一步改善(表1)。

Tab.1 Comparison of±dp/dtmax in each group between 6week and 10 week(mmHg/s, ±s,n=30)

Tab.1 Comparison of±dp/dtmax in each group between 6week and 10 week(mmHg/s, ±s,n=30)

SH:Sham operation group;CAA:Coarctation of abdominal aorta group;CAP:Captopril intervention group;±dp/dt max:Rate of rise or descend of left ventricular pressure**P＜0.01 vs CAA 6 week group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs CAP 6 week group

Group week +dp/dtmax -dp/dtmax SH 6 3602.28±226.37 3138.74±226.12 10 3779.81±336.77 3146.02±273.37 CAA 6 1145.38±103.39 785.79±74.78 10 844.13±173.20** 671.08±38.40**CAP 6 2142.29±236.94 2019.92±157.42 10 2766.20±204.85## 2247.90±277.56#

2.2 各組大鼠心肌Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平比較

6周及10周時(shí)CAA組較SH組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降(P＜0.01),Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.01),Bcl-2/Bax比例顯著下降(P＜0.01)。6周及10周時(shí)CAP組較CAA組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.01),Bax蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01),Bcl-2/Bax比例顯著升高(P＜0.01,表2)。

2.3 10周Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax比例與6周時(shí)比較

10周時(shí)SH組間心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。CAA組較 6周時(shí) Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01),Bcl-2/Bax比例顯著降低(P＜0.01)。CAP組較6周時(shí) Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05),Bax蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01),Bcl-2/Bax比例顯著升高(P＜0.01,表 2)。

Tab.2 Comparison of Bcl-2、Bax and Bcl-2/Bax in each group between 6 week and 10 week(±s,n=30)

Tab.2 Comparison of Bcl-2、Bax and Bcl-2/Bax in each group between 6 week and 10 week(±s,n=30)

SH:Sham operation group;CAA:Coarctation of abdominal aorta group;CAP:Captopril intervention group**P＜0.01 vs SH group;##P＜0.01 vs CAA group;△△P＜0.01 vs CAA 6 week group;▲P ＜0.05,▲▲P ＜0.01 vs CAP 6 week group

Group week Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax SH 6 460.80±17.87 330.97±20.79 1.40±0.14 10 473.70±21.32 339.29±9.21 1.40±0.05 CAA 6 390.97±20.71** 630.42±9.46** 0.62±0.04**10 348.89±19.63**△△ 659.83±32.81** 0.53±0.05**△△CAP 6 601.16±12.35## 504.22±27.77## 1.20±0.08##10 626.30±20.45##▲ 414.35±31.19##▲▲1.52±0.15##▲▲

3 討論

縮窄腹主動(dòng)脈導(dǎo)致慢性壓力負(fù)荷造成大鼠腎臟缺血,導(dǎo)致腎素生成增加,兒茶酚胺增加,血壓升高。縮窄腹主動(dòng)脈可直接使血壓升高,心臟后負(fù)荷加重,造成左心室肥厚導(dǎo)致左心衰竭。近年來(lái)有研究提示心肌細(xì)胞凋亡所致的心肌細(xì)胞減少是心力衰竭重要的發(fā)病學(xué)機(jī)制[4]。ACEI類(lèi)藥物卡托普利可降低血循環(huán)和心臟組織內(nèi)的血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的水平,抑制緩激肽分解、降低金屬蛋白酶活性,抑制心肌纖維化和瘢痕形成,改善梗死心肌高能磷酸鹽代謝。

在細(xì)胞凋亡過(guò)程中,Bcl-2蛋白抑制細(xì)胞凋亡,而B(niǎo)ax蛋白則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2與Bax的比例決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。高水平的Bcl-2/Bax有助細(xì)胞生存,過(guò)低則促進(jìn)凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:模型組及治療組大鼠心肌細(xì)胞中存在Bcl-2蛋白的表達(dá),在CAA組Bcl-2蛋白表達(dá)較低,而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)最高,Bcl-2/Bax比值最低,證實(shí)模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡最明顯。在利用卡托普利治療6周、10周后,Bcl-2蛋白表達(dá)較CAA組增多,Bax蛋白表達(dá)下降,Bcl-2/Bax比值升高,且10周治療效果與6周比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,證實(shí)卡托普利治療后慢性壓力負(fù)荷性心衰大鼠心肌細(xì)胞凋亡受到抑制,心功能改善。現(xiàn)在臨床上應(yīng)用ACEI類(lèi)及ARB類(lèi)藥物改善心室重構(gòu)的研究越來(lái)越普遍,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,ARB可抑制心肌梗死大鼠的心肌肥厚和纖維化[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步提示卡托普利對(duì)細(xì)胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2的影響,可能為其治療心力衰竭的主要機(jī)制之一。

研究結(jié)果提示卡托普利能夠抑制細(xì)胞凋亡,為我們?cè)谂R床應(yīng)用開(kāi)辟了新的思路,對(duì)其機(jī)理的深入研究有助于探討ACEⅠ類(lèi)藥物治療心力衰竭的機(jī)制,進(jìn)而為其在臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

[1]Sabbah H N,Sharov V G,Goldstein S.Programmed cell death in the progression of heart failure[J].Ann Med,1998,30(Suppl 1):33-38.

[2]Kang PM,Izumo S.Apoptosis and heart failure:a critical review of the literature[J].Circ Res,2000,86(11):1107-1113.

[3]王艷飛,曹雪濱,崔英凱,等.改良大鼠左心室插管術(shù)及心衰大鼠左心功能指標(biāo)的測(cè)定[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2008,18(12):34-36.

[4] Els?sser A,Suzuki K,Schaper J.Unresolved issues regarding the role of apoptosis in the pathogenesis of ischemic injury and heart failure[J].J Mol Cell Cardiol,2000,32(5):711-724.

[5]孫 靜,張世殊,毛用敏,等.西拉普利和纈沙坦對(duì)大鼠心肌梗死后心肌間質(zhì)成分水平的干預(yù)研究[J].中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué),2007,19(4):244-245.