急性減壓病大鼠肺組織粘附分子的變化*

包曉辰,方以群,馬 駿,孟 淼

(海軍醫學研究所,上海 200433)

隨著深海石油及水下作業的開發,潛水在經濟建設中的作用日益突出。但是潛水減壓病限制了應用潛水技術的發展。減壓病(decompression sickness,DCS)是機體在某一氣壓環境下,暴露一定時間后,由于減壓不當導致機體組織內原來溶解的惰性氣體游離為氣相,形成氣泡,從而導致的一系列病理反應的疾病[1]。目前對減壓病的發病機理尚未完全了解,有文獻認為血管內皮屏障的破壞、粘附分子及炎性介質的上調可能在減壓病發病中起著重要作用[2]。為了解減壓病時血管內皮屏障通透性及粘附分子的表達改變,我們設計了本實驗。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

70只健康雄性SD大鼠購自上海西普爾畢凱實驗動物有限公司,平均體重250 g,海軍醫學研究所動物飼養中心飼養。觀察和檢疫一周正常后進行實驗。

1.2 主要試劑

大鼠種屬特異性細胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、E-選擇素(E-selectin)、主要組織相容性復合體-II(major histocompatibility complex class II molecule,MHC-II)抗體購自美國Santa Cruze公司。Evans Blue溶液及甲酰胺購自美國sigma公司。ABC試劑盒及DAB顯色試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.3 急性減壓病大鼠模型建立及評價

70只雄性 SD大鼠,隨機分為四組:對照組、減壓后30 min觀測組、減壓后6 h觀測組、減壓后24 h觀測組。減壓組大鼠置于加壓艙內,艙底鋪設新鮮鈉石灰,壓縮空氣在3 min內勻速加壓至0.7 MPa,停留60 min后,3 min內快速減壓出艙。期間每隔20 min通風一次,每次1 min,保持艙內氧濃度在19%以上,二氧化碳濃度在相當于常壓下的0.5%以下。出艙后觀察急性減壓病的癥狀,評價包括:行走困難、不正常的呼吸、前/后肢癱瘓及死亡。對照組大鼠也置于加壓艙內,在1ATA下保持1 h。減壓后30 min取出現減壓病癥狀大鼠及對照組大鼠的肺、肝、腦組織,甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片、HE染色后觀察病理變化。

1.4 肺血管滲透性測定

在減壓后6 h、24 h前30 min,每組取5只大鼠,尾靜脈注射2%evans blue溶液(20 mg/kg)。30 min后,生理鹽水進行灌注,取肺組織,觀測組織藍染程度。肺組織勻漿后溶于2倍體積的甲酰胺中,60℃孵育16 h后,5 000×g離心30 min,取上清液100 μ l加入96孔板中,分光光度計吸收波長620 nm分析;OD650/g(肺組織重量)的比值可用來衡量體內血管的滲透性。

1.5 免疫組化測定肺組織粘附分子表達

在減壓后 30 min、6 h、24 h,每組取 5只大鼠,1%戊巴比妥鈉麻醉后,生理鹽水灌注后,4%多聚甲醛灌注固定。取肺組織,后固定1.5 h,10%蔗糖浸泡24 h,組織在恒冷箱切片機切14 μ m的切片。分別加入下列一抗ICAM-1(1∶25)、E-selectin(1∶250)、MHC-II(1∶100),4℃孵育 24 h,PBS沖洗后,加入種屬特異性二抗(1∶200),室溫孵育3～4 h,加入AB混合液后,室溫孵育3 h,DAB顯色、脫水、透明、封片。光鏡下觀測陽性表達率。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 急性減壓病大鼠模型的建立

大鼠在不安全減壓后均出現懶動、反應遲鈍、呼吸急促的癥狀,少數大鼠出現肢體癱瘓。這些癥狀在減壓后30 min內最為顯著,其中有約50%的大鼠在減壓后15 min內出現呼吸急促、抽搐、死亡;10%的大鼠出現癱瘓、呼吸急促,在出艙后12 h內死亡;其余大鼠在減壓后出現呼吸急促、懶動、豎毛等癥狀,在2 h內恢復。

2.2 急性減壓病大鼠的組織病理表現

組織病理顯示:出現急性減壓病癥狀大鼠的肺、肝及大腦皮層均出現不同程度的病變:肺臟組織明顯充血水腫,肺泡結構破壞,肺泡間隔增厚,支氣管旁大量炎性細胞侵潤;肝臟呈現顯著的淤血,但肝小葉結構完整;大腦皮質呈現輕微的水腫,軟腦膜有少量的淤血,余無異常表現(圖1)。

Fig.1 Tissue pathology of the lung,liver and cerebral cortex of rats sufferedwith DCS(HE stain ×200)

2.3 急性減壓病大鼠肺組織血管滲透性測定

Evans blue可以與血中白蛋白結合,正常生理狀態的血管內皮作為一道屏障可以阻礙其與血中白蛋白結合,當血管內皮損傷時,Evans blue因可和滲漏出的白蛋白結合,使組織染色。因而被廣泛用于評估體內外血管滲透性。在本實驗中,我們應用該染色方法探討急性減壓病時大鼠肺血管滲透性的改變。結果發現:急性減壓病大鼠肺組織的藍染程度顯著增加,減壓后6 h顯著,24 h仍藍染明顯(圖2A)。定量分析發現,相對于對照組的OD620值(6.53±1.32),減壓后 6 h及 24 h肺組織中Evans blue的含量顯著增加(OD620值分別為12.78±0.69,10.34±1.27,P＜0.05,圖2B)。

Fig.2 Vascular leakage in the lungs was assessed in SD rats post decompression(±s,n=5)

2.4 急性減壓病可引起肺組織粘附分子的表達上調

E-selectin表達在減壓后30 min及6 h在肺組織中表達上調,在減壓后24 h恢復至接近基值;ICAM-1在減壓后6 h在肺組織中表達上調,在減壓后24 h仍上調顯著;MHC-II在減壓后6 h表達上調明顯,24 h回復基值(表1)。

Tab.1 Immunostaining for E-selectin,ICAM-1 and MHC-II protein in the lung of rats post decompression(IOD value,±s,n=5)

Tab.1 Immunostaining for E-selectin,ICAM-1 and MHC-II protein in the lung of rats post decompression(IOD value,±s,n=5)

IOD:Mean area×mean density;RD:Rapid decompression*P＜0.05 vs control group

Group ICAM-1 E-selectin MHC-II Control 19.37±5.57 20.51±7.53 5.58±2.90 30 min post RD 21.06±5.91 125.79±10.53*7.66±3.01 6 h post RD 42.28±4.27*128.68±10.99*11.89±3.05*24 h post RD 54.59±8.96*38.75±19.97 9.23±4.28

3 討論

Eckmann等報導不安全減壓產生的大量氣泡可聚集在血管,導致血管阻塞及增加內皮細胞間的縫隙連接。血管長時間的阻塞,可導致內皮組織缺血缺氧,內皮細胞激活,血管內的炎性細胞聚集至內皮細胞表面,釋放氧自由基、蛋白酶,進一步損害內皮組織,激活炎癥介質的釋放,使機體呈現一前致炎性狀態[3-4]。因此Madden等提出假設:氣泡導致的,細胞因子介導的內皮損傷可能是急性減壓病的發病原因之一[5]。

內皮細胞的受損可導致細胞激活,內皮細胞激活狀態下可誘導粘附分子的表達。這些內皮細胞激活標記可表達在不同階段。如P-selectin在激活后幾分鐘內就可出現,從而促進細胞粘附的進展,而E-selectin在激活后4～6 h達到高峰。ICAM-1及VCAM-1的增高可持續數天[6]。因為DCS表現出類似于系統性炎癥反應的癥狀[7],因此我們推測不安全減壓后機體產生的細胞因子可介導內皮細胞的激活,引起粘附分子表達上調。我們在本部分實驗中采用免疫組化的方式檢測肺組織中 E-selectin、ICAM-1及MHC-II的表達變化。之所以選擇了肺組織,因為肺是減壓病的靶器官,是靜脈氣泡的早期過濾器,因為壓力比體循環中低,因此更容易在減壓過程中形成氣泡。Nyquist等報道重型減壓病時肺組織是炎性細胞聚集最為顯著的地方,也支持這一觀點[8]。

結果發現肺組織中粘附分子表達上調,且在減壓后30 min至6 h最為顯著。其中,ICAM-1表達在減壓后6 h在肺組織中表達上調,在減壓后24 h仍上調顯著。E-selectin在減壓后30 min及6 h在肺組織中表達上調,在減壓后24 h恢復至接近基質。MHC-II在減壓后6 h表達上調明顯,24 h后回復基值。這和上述文獻結果相符合。ICAM-1在正常狀態下極微量的表達于內皮細胞表面,在TNF-α和IFN-γ的刺激下,血管內皮細胞表面的ICAM-1可增高,且增高可持續數天[9],因此,在本實驗中,ICAM-1的表達在減壓后24 h仍增高明顯。ICAM-1激活時可和白細胞表面的LFA-1受體相結合,從而介導白細胞和內皮細胞的粘附。E-selectin只表達在經炎癥因子激活的內皮細胞表面,可促進白細胞粘附至受損的內皮細胞上,可被TNF-α和IL-1所激活。E-selectin在激活后4～6 h達到高峰,在本實驗中,我們發現E-selectin在減壓后6 h達高峰。IFN-γ可激活血管內皮細胞表面表達MHC-II類分子,介導白細胞和內皮細胞的結合[8],本實驗中,MHC-II表達在減壓后6 h上調明顯。

粘附分子的增高趨勢和組織的病理表現及大鼠的臨床癥狀呈現一致性。組織病理顯示:肺、肝及大腦皮質均在減壓后30 min內病損最為顯著,表現為肺組織的充血水腫、肺泡結構的消失;肝臟淤血;大腦皮質的水腫及淤血。該現象和我們前期發現的急性減壓病兔的病理表現相一致,提示快速減壓后1 h為重型減壓病搶救的關鍵時期[10]。同時提示我們,除了肺組織是減壓病的靶器官之外,肝臟及中樞神經系統的損傷也較明顯,因此在后期的實驗中,應對減壓病導致的其它系統的損傷進行進一步研究。

為更進一步檢測減壓病時肺血管內皮屏障的破壞,在本實驗中,我們也采用了evans blue染色法。結果發現急性減壓病大鼠肺組織的血管滲透性明顯增加,即使在減壓后24 h,大鼠無明顯癥狀體征時,肺臟血管滲透性仍顯著增加。該現象提示肺血管內皮屏障顯著破壞,同時提示即使是無明顯癥狀的大鼠,肺組織的損傷還是存在的。

因此,根據上述實驗結果,我們認為不安全減壓產生的大量氣泡,可導致血管內皮受損,受損的血管內皮,可誘導內皮細胞粘附分子表達上調,白細胞粘附至內皮細胞表面,進一步損傷血管內皮屏障。

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[5]Madden L A,Laden G.Gas bubbles may not be the underlying cause of decompression illness-The at-depth endothelial dysfunction hypothesis[J].Med Hypotheses,2009,72(4):389-392.

[6]Yusuf-Makagiansar H,Anderson M E,Yakovleva T V,et al.Inhibition of LFA-1/ICAM-1 and VLA-4/VCAM-1 as a therapeutic approach to inflammation and autoimmune diseases[J].Med Res Rev,2002,22(2):146-167.

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[10]包曉辰,方以群,李 慈,等.兔實驗性重型減壓病時組織的病理變化[J].中華航海醫學與高氣壓醫學雜志,2010,6(16):321-324.