當歸對宮內低氧新生大鼠海馬神經元與神經膠質細胞的影響及其機制*

馬 晶,丁誠實,余 鴻

(1.棗莊職業學院醫學系,山東棗莊 277800;2.棗莊學院生命科學學院,山東 棗莊 277160;3.瀘州醫學院 組胚教研室,四川 瀘州 646000)

當歸是國藥精華,其味甘而重,專能補血;其氣輕而辛,又能行血。由于其作用廣泛、副作用小,使其在婦產科臨床上具有獨特的優勢。研究表明當歸可以減弱低氧時神經元的變性[1],但其如何對抗神經系統的損傷機制還有待研究。近年來研究發現,血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)具有類似血管源性的神經保護和神經營養作用,但VEGF是否也參與宮內低氧新生大鼠的神經系統的改變目前尚不確定。本實驗在前期的研究基礎[2]上進一步延長低氧時間(低氧5 d),觀察神經元及神經膠質細胞的變化,研究當歸對其是否有干預作用并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

SD雌、雄大鼠各15只(220～260 g)由瀘州醫學院動物實驗中心提供(一級合格動物,許可證號:川實動管質第17號);大鼠神經特異性烯醇化酶(neurone specific enolase,NSE)mR NA、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)mR NA、VEGF mRNA原位雜交檢測試劑盒,3,3'-二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程公司;原位雜交用焦碳酸二乙酯(DEPC)由第四軍醫大學試劑公司提供;250 g/L的當歸注射液(購自武漢大學中南醫院,生產批號:070823)。三氣培養箱購自美國REVCO COMPANY;切片機為德國萊卡產品;OLYMPUS Ax-70顯微成像系統購自日本OLYMPUS光學儀器有限公司;Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統為Media Cybernetics公司產品。

1.2 動物及分組

雌大鼠分別與雄大鼠合籠配種,次日晨見陰栓記為大鼠懷孕0 d,孕鼠隨機均分為對照組、低氧組和當歸組。

1.3 宮內低氧動物模型制備

參照本實驗小組前期制作的宮內低氧模型[3],但延長低氧時間。當歸組孕鼠自孕第l4天開始,每天下午2∶00經尾靜脈注射250 g/L的當歸注射液8 ml/kg(孕第14～20天,連續7 d),1 h后放入設置好的三氣培養箱(氧體積分數130ml/L,溫度25℃ ,二氧化碳體積分數0.4～0.6ml/L)內低氧2 h,連續低氧5 d(孕第14～18天),第 19、20天仍給予當歸注射液,但不低氧。低氧組用9 g/L鹽水代替當歸注射液,其余同當歸組。對照組不低氧,余同低氧組。

1.4 取材、石蠟切片與原位雜交

每只孕鼠分娩當天隨機選取新生大鼠4只,每組得新生鼠20只,取新生大鼠腦、40 g/L多聚甲醛固定60 min、石蠟包埋(試劑中含1 ml/L的DEPC)、海馬冠狀切面切片。切片作NSE mRNA、GFAP mRNA、VEGF mRNA 原位雜交,切片常規脫水、透明、封片。每張切片在400倍下用OLYMPUS Ax-70顯微成像系統對海馬CA3區拍照。

1.5 圖像分析

采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統,分析原位雜交圖并統計其積分光密度(IOD)值。

1.6 統計學處理

采用SPSS 16.0軟件包完成數據分析。數據采用均值±標準差(±s)表示,組間比較用LSD法檢驗。

2 結果

2.1 NSE mRNA原位雜交染色結果

NSE mRNA原位雜交反應陽性細胞細胞質被染為棕黃色,胞質中央為卵圓形或圓形空泡。主要分布錐體細胞層、分子層。低氧組NSE mRNA原位雜交反應陽性細胞的分布與對照組相似,但陽性細胞較對照組染色減弱、數量減少,其積分光密度值均減小(P＜0.05)。當歸組NSE mRNA原位雜交反應陽性細胞分布與對照組相似,但較低氧組染色增強、數量增多,其積分光密度值增大(P＜0.05,圖1,表1)。

2.2 各組新生鼠海馬CA3區GFAP mRNA原位雜交結果

GFAP mRNA原位雜交陽性細胞胞質染為棕黃色,主要分布于錐體細胞層、分子層和多形細胞層。對照組陽性細胞淺染,數量少。低氧組陽性細胞染色深,數量較對照組增多,尤其以分子層變化明顯。當歸組陽性細胞較低氧組染色明顯減弱,數量明顯減少(P＜0.05,圖2,表1)。

2.3 各組新生鼠海馬CA3區VEGF mRNA原位雜交結果

VEGF mRNA原位雜交陽性細胞胞質染為棕黃色,陽性細胞主要分布于錐體細胞層,細胞大而圓。對照組分布較集中,陽性細胞染色較淺。低氧組陽性細胞較對照組染色加深,數量增多,分子層和多形細胞層出現較多陽性細胞。當歸組陽性細胞較低氧組染色加深,陽性細胞數量明顯增多,尤以分子層最為明顯(P＜0.05,圖3,表1)。

Fig.1 NSE mRNA positive cells in hippocampal CA3 area of neonatal rat(ISH ×400)

Fig.2 GFAP mR NA positive cells in hippocampal CA3 area of neonatal rat(ISH ×400)

Fig.3 VEGF mRNA positive cells in hippocampal CA3 area of neonatal rat(ISH ×400)

Tab.1 IOD of NSE mRNA,GFAP mRNA,VEGF mRNA positive cell(±s,n=20)

Tab.1 IOD of NSE mRNA,GFAP mRNA,VEGF mRNA positive cell(±s,n=20)

NSE:Neurone specific enolase;GFAP:Glial fibrillary acidic protein;VEGF:Vascular endothelial growth factor;IOD:Integrated optical density*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs hypoxia

Group NSE GFAP VEGF Control 83.85±5.52 7.24±1.78 63.62±6.08 Hypoxia 52.18±4.98*16.78±4.02*75.80±5.55*Angelica 72.25±3.29*#9.78±2.79#89.15±9.90*#

3 討論

本實驗結果發現,宮內低氧(130ml/L)連續5d(2 h/d)后海馬CA3區NSE mRNA原位雜交陽性物質表達比對照組明顯減弱,陽性細胞減少,積分光密度值減小,提示胚胎海馬的神經元出現了壞死和/或凋亡,導致神經元數量減少,低氧對神經元起到了損傷作用。本實驗原位雜交結果顯示低氧組海馬CA3區GFAP mRNA陽性細胞數量和染色均較對照組明顯增多,說明低氧刺激了該區膠質細胞增生,其可能與膠質細胞參與了神經系統的修復相關,是神經系統對低氧的適應性反應。而當歸組GFAP mRNA較低氧組減少,說明當歸在一定程度上減弱了由于低氧導致的該區膠質細胞的增生。在神經系統中,膠質細胞的數量是神經元的數十倍,而神經元損傷時,膠質細胞增生、肥大,形成膠質瘢痕予以修復損傷區域。結合本實驗結果,可見膠質細胞在神經系統低氧修復時起了重要作用。實驗中低氧組VEGF mRNA較對照組增多,當歸組VEGF mRNA較低氧組進一步增多,說明低氧可上調VEGF mRNA的表達,而當歸注射液可進一步上調VEGF mR NA的表達。結合NSE mRNA結果分析,說明低氧后VEGF mRNA的上調表達所產生的抗凋亡等神經保護作用還不足以抵抗由于持續5 d(2 h/d)的宮內低氧(130 ml/L)導致的神經元損傷作用,從而使低氧組NSE mRNA的IOD值較對照組減小;而當使用當歸注射液后使VEGF mRNA的表達進一步上調,從而進一步增強了VEGF的神經保護作用,使當歸組NSE mRNA的IOD值較低氧組增大。有研究表明VEGF大量表達有利于大腦損傷的修復、功能的完善,其機制可能與促進血管發生、保護神經組織、促進膠質細胞增生及修復等作用密切相關;大量的VEGF表達增加了腦血管通透性,使用VEGF受體阻滯劑反而減輕了腦組織的急性興奮性損傷[4],這可能和VEGF的量及出現在損傷后的時間有密切關系。

現代研究發現,當歸屬根中提取的前胡素、前胡醇衍生物等具有高活性的神經保護作用,通過多種機制減少氧化應激引起的細胞損傷。結合本實驗結果,推測低氧刺激產生的神經保護作用可能與當歸對內源性VEGF的激活有關。

[1]Wu Y L,Zhao H X,Yu H.Protective effect of Angelica sinensis on cerebral neurons from rat embryos under hypoxia[J].Neural Regen Res,2007,2(1):46-49.

[2]Yue H S,Chen X D,Zhong X M,et al.Effect of Angelica sinensis on neural stem cell proliferation in neonatal rats following intrauterine hypoxia[J].Neural Regen Res,2008,3(7):733-736.

[3]鐘小明,陳旭東,鐘 梅,等.宮內缺氧對幼年大鼠神經干細胞增殖及學習記憶能力的影響[J].實用兒科臨床雜志,2008,23(2):146-147,156.

[4]Ryu J K,McLarnon J G.VEGF receptor antagonist Cyclo-VEGI reduces inflammatory reactivity and vascular leakiness and is neuroprotective against acute excitotoxic striatal insult[J].J Neuroinflammation,2008,5:18.