高糖誘導腎小球系膜細胞表達TNF-α的機制探討*

張 怡,黃國良

(福建醫科大學附屬協和醫院內分泌研究所,福州 350001)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病常見和嚴重的慢性并發癥之一,近年來炎癥因子及炎癥反應成為了DN的新視點。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是糖尿病腎病時的主要相關炎癥因子,已有研究證實糖尿病腎病時血清中TNF-α表達明顯升高,且與C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)水平及DN的程度一致[1]。TNF-α通過與受體的結合,激活許多信號傳導通路,導致多種轉錄因子的表達,有證據證明TNF-α參與DN病理生理機制,調控糖尿病腎損傷不同效應。我們可通過阻斷其產生的通路來預防DN的發生,但目前對于其產生的機制尚未有研究報道。本研究在體外模擬糖尿病高血糖環境,就高糖環境下腎小球系膜細胞表達TNF-α的機制方面進行初步的研究和探討。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

人腎小球系膜細胞株為福建醫科大學附屬協和醫院內分泌研究所保藏,常規細胞培養。p38MAPK特異性抑制劑SB203580購自sigma公司,NF-κ B特異性抑制劑 PDTC購自碧云天生物技術研究所,總RNA提取試劑Trizol購自加拿大Bio Basic Inc公司,RIPA裂解液、細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒均購自碧云天生物技術研究所,RT-PCR試劑盒購自Fermentas公司,磷酸化p38MAPK蛋白一抗購自Cell signaling technology,NF-κ Bp65蛋白一抗購自碧云天生物技術研究所,PCR擴增儀為美國ABI公司產品,凝膠成像分析系統為Tanon Gis產品,垂直電泳系統和電轉系統為Bio-Rad公司產品。

1.2 腎小球系膜細胞培養及處理

腎小球系膜細胞以105cells/well密度接種于6孔培養板中,用含10%胎牛血清的1640培養液進行培養,37℃、5%CO2溫箱孵育至亞融合狀態后更換為無血清培養液培養24 h使之同步化,然后根據實驗分組要求換用加入各種處理因素的1%胎牛血清培養液繼續培養。實驗分組為低糖對照組(5.6 mmol/L);高糖組(20 mmol/L);高糖(20 mmol/L)+SB203580(10 μ mol/L)組 ;高 糖(20 mmol/L)+PDTC(10 μ mol/L)組 。SB203580或PDTC預處理系膜細胞30 min后,再加入高糖溶劑使培養液葡萄糖終濃度達到20 mmol/L。作用48 h后分別測定系膜細胞TNF-αmRNA、磷酸化p38MAPK蛋白、NF-κ B p65蛋白表達。

1.3 RT-PCR方法檢測系膜細胞TNF-αmRNA表達

細胞用PBS迅速沖洗2次,提取細胞總RNA,用紫外分光光度計測定其濃度和純度,計算樣品總RNA濃度。取總RNA 2 μ g,進行逆轉錄反應。TNF-α引物(上游 5'-CAGAGGGAAGAGTTCCCCAG-3',下游5'-CCTTGGTCTGGTAGGAGACG-3')是根據Li等的序列設計[2],由 Invitrogen公司合成的,可擴增出長度為325 bp的TNF-αcDNA片段;β-actin引物(上游5'-GGCATGGGTCAGAAGGATTCC-3',下游5'-ATGTCACGCACGATTTCCCGC-3')為福建醫科大學協和臨床醫學院血液研究所饋贈,可擴增出長度為500 bp的β-actin cDNA片段。PCR反應條件:TNF-α:94℃變性40 s,64℃退火40 s,72℃延伸40 s;β-actin:94℃變性30 s,58℃退火30s,72℃延伸30 s,共進行35個循環,首次循環前先在94℃預變性5 min,最后一輪循環后在72℃終末延伸7 min。PCR產物于含1%Goldview核酸染料的1.5%瓊脂糖凝膠電泳,以DNA Marker(600 bp)作為標準分子量標記,電泳后于紫外透射儀觀察并拍照,應用凝膠圖像分析系統軟件對目的電泳條帶進行分析,以相應的內參電泳條帶作為參照,結果以兩者之積分吸光度的比值表示。每組樣本數是3例。

1.4 Western blot法檢測系膜細胞磷酸化p38MAPK蛋白及NF-κ B p65蛋白表達

細胞用PBS迅速沖洗2次,加入RIPA裂解液在冰上孵育30 min,4℃、14 000 r/min離心 15 min提取總蛋白;按照試劑盒說明書操作提取細胞核蛋白與細胞漿蛋白。按照BCA試劑盒說明書操作測定各組蛋白濃度,以Western blot法分別檢測細胞內磷酸化p38MAPK蛋白水平、細胞核與細胞漿NF-κ B p65蛋白水平。經圖像分析系統對目的條帶及內參條帶進行掃描和灰度分析,結果以兩者灰度比值表示。每組樣本數是3例。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 SB203580、PDTC對高糖培養系膜細胞 TNF-αmRNA表達的影響

與低糖對照組相比,高糖組系膜細胞TNF-αmRNA表達明顯增加(P＜0.01)。而與高糖組相比,SB203580組、PDTC組系膜細胞TNF-αmRNA表達均明顯降低(P＜0.01)。表明高糖可誘導系膜細胞內TNF-α在基因水平的表達,抑制系膜細胞p38MAPK、NF-κ B活性可明顯抑制高糖誘導系膜細胞內TNF-α的表達(表1)。

Tab.1 Changes of TNF-αmRNA expression in glomerular mesangial cells(±s,n=3)

Tab.1 Changes of TNF-αmRNA expression in glomerular mesangial cells(±s,n=3)

HG:High glucose group;SB203580:p38MAPK specific inhibitor;PDTC:NF-κ B specific inhibitor;TNF-α:Tumor necrosis factor-α**P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HG group

Control 0.3772±0.0332 HG 0.8890±0.0228**SB203580 0.4963±0.0284##PDTC 0.4734±0.0292##

2.2 SB203580對高糖培養系膜細胞磷酸化p38MAPK表達的影響

與低糖對照組相比,高糖組系膜細胞磷酸化p38MAPK蛋白表達增加(P＜0.01)。與高糖組相比,SB203580組系膜細胞磷酸化p38MAPK蛋白表達減少(P＜0.01,圖1)。表明高糖可誘導系膜細胞內p38MAPK蛋白活化,SB203580明顯抑制了高糖誘導系膜細胞內p38MAPK蛋白的活化(圖2)。

Fig.1 Expression of phosphorylation p38MAPK in glomerular mesangial cells stimulated by SB203580 and high glucose

2.3 SB203580對高糖培養系膜細胞NF-κ B p65蛋白表達的影響

與低糖對照組相比,高糖組系膜細胞NF-κ B p65蛋白在胞核內表達增加(P＜0.01),胞漿內表達減少(P＜0.01)。而與高糖組相比,SB203580組系膜細胞NF-κ B p65蛋白在胞核內表達減少(P＜0.01),胞漿內表達增加(P＜0.01,圖3)。表明高糖可誘導系膜細胞內NF-κ B蛋白轉核活化,SB203580可明顯抑制高糖誘導系膜細胞內NF-κ B蛋白的活化(圖4)。

3 討論

Fig.2 Effect of SB203580 on phosphorylation p38MAPK expression in glomerular mesangial cells(±s,n=3)

Fig.3 Expression of NF-κ B p65 in glomerular mesangial cells stimulated by SB203580 and high glucose

Fig.4 Effect of SB203580 on NF-κ B p65 expression inglomerular mesangial cells(±s,n=3)

近年來的研究表明慢性低度炎癥可能誘導了2型糖尿病患者的腎臟病變,而前炎癥因子是導致慢性低度炎癥的始發及促進因素之一,TNF-α是目前研究較為廣泛的前炎癥因子。TNF-α參與多種生理和免疫過程,具有抗腫瘤、促進細胞生長、誘導細胞分化凋亡、影響糖脂代謝、誘導多種細胞因子產生等生物功能。Navarro等研究發現,DN患者與糖尿病無腎病改變患者相比血漿及尿液中TNF-α的表達明顯升高,且與DN病理分期成正相關[3]。與此研究一致,本實驗結果顯示,高糖培養腎小球系膜細胞內TNF-αmRNA表達升高。Bai等的研究發現,p38MAPK抑制劑及NF-κ B抑制劑均可抑制高半胱氨酸誘導的人臍靜脈內皮細胞表達TNF-α[4]。故我們猜測,p38MAPK抑制劑及NF-κ B抑制劑亦可抑制高糖誘導系膜細胞表達TNF-α。

p38MAPK是MAPK家族的一員,是調節許多細胞功能的一個重要激活信號分子,磷酸化 p38MAPK為其活性形式。本研究發現,高糖可誘導腎小球系膜細胞內p38MAPK活化,而p38MAPK特異性抑制劑SB203580可明顯抑制TNF-αmRNA表達,表明p38MAPK參與介導高糖誘導TNF-α表達。

NF-κ B是由Rel蛋白家族的成員以同源或異源二聚體的形式組成的一組轉錄因子,參與細胞內的信號傳遞,調控多種基因的表達。Navarro等研究發現,鏈脲霉素誘導糖尿病腎病大鼠的腎臟組織中NF-κ B亞單位p50及p65明顯升高,與血糖、尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rates,UAER)及血肌酐升高呈明顯正相關[5]。我們的研究也發現,高糖可誘導腎小球系膜細胞內NF-κ B蛋白轉核活化,NF-κ B特異性抑制劑PDTC可明顯抑制TNF-αmRNA表達。同時本研究顯示,SB203580可明顯抑制高糖誘導腎小球系膜細胞內NF-κ B蛋白轉核活化,表明p38MAPK與NF-κ B存在相互作用,二者共同參與介導高糖誘導系膜細胞內TNF-α表達,且存在交叉作用。

本研究初步闡明了高糖誘導腎小球系膜細胞表達TNF-α的相關機制,為糖尿病腎病的治療提供全新的理論基礎,同時也為臨床提供新的更為有效的診治手段。

[1]馬直勉,李海永.血清C-反應蛋白、TNF-α、IL-6與 2型糖尿病腎病的關系[J].國際免疫學雜志,2007,30(6):367-369.

[2]Li H,Li X W,Duan L,et al.Inhibition of lovastatin on proliferation and expression of proinflammatory cytokines in cultured human glomerular mesangial cells[J].Chinese Medical Journal,2003,116(9):1366-1369.

[3]Navarro J F,Mora C,GomezM,et al.Influence of renalinvolvement on peripheral blood mononuclear cell expression behaviour of tumour necrosis factor-α and interleukin-6 in type 2 diabetic patients[J].NephrolDialTransplant,2008,23(3):919-926.

[4]Bai Y P,Liu Y H,Chen J,et al.Rosiglitazone attenuates NF-kappaB-dependent ICAM-1 and TNF-alpha production caused by homocysteineviainhibiting ERK1/2/p38MAPK activation[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,360(1):20-26.

[5]Navarro J F,Mora C.Diabetes,inflammation,proinflammatory cytokines,and diabetic nephropathy[J].Scientific World J,2006,6:908-917.