白藜蘆醇對脂多糖激活小膠質(zhì)細(xì)胞cdk5表達(dá)的影響*

李 爽,張 艷,姜洪波,杜愛林,徐春陽

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,2.免疫學(xué)教研室,3.三附院,河南新鄉(xiāng) 453003)

小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布較廣,激活 后參與損傷、炎癥、阿爾茨海默病等許多神經(jīng)損傷過程,其損失機(jī)制尚未完全清楚。白藜蘆醇(resveratrol,Res),是一類主要存在于葡萄、藜蘆、虎杖等植物中的多酚類化合物,具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗高血脂癥、抗脂質(zhì)過氧化等多種活性,已經(jīng)應(yīng)用于多種疾病的防治。本實驗通過觀察白藜蘆醇對脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活小膠質(zhì)細(xì)胞的影響及小膠質(zhì)細(xì)胞中cdk5表達(dá)的變化,來探討白藜蘆醇神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

白藜蘆醇、LPS、四氮唑鹽復(fù)合物(XTT):美國Sigma公司;兔抗鼠cdk5多克隆抗體(北京博奧森),Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG(碧云天)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

N9小膠質(zhì)細(xì)胞由上海中科院惠贈,采用IMDM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng),0.25%的胰酶消化傳代,取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3 XTT法檢測細(xì)胞存活率

取對數(shù)生長期的N9細(xì)胞,以5×105cells/ml接種于96孔板內(nèi),100μ l/well,細(xì)胞貼壁培養(yǎng) 24 h后,加藥處理。白藜蘆醇劑量設(shè)置為5,10,20,40,80(μ mol/L)單獨或與LPS(1 μ g/ml)共同作用,同時設(shè)空白對照。每個濃度設(shè)六個平行孔。細(xì)胞加藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,每孔加入50 μ l XTT/PMS混合液,置培養(yǎng)箱中37℃孵育2 h,酶標(biāo)儀測定450 nm波長處吸光度值(A)。根據(jù)下列公式計算細(xì)胞平均存活率:存活率 =A藥物處理組/A對照組×100%,實驗重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞分組

白藜蘆醇最終劑量根據(jù)XTT法確定(去除對細(xì)胞存活率有明顯影響的白藜蘆醇劑量)。對數(shù)期細(xì)胞以5×105cells/ml接種,分為對照組(不施加任何處理)、LPS 組(1 μ g/ml LPS刺激)、白藜蘆醇低劑量+LPS組(5μ mol/L白藜蘆醇+1 μ g/ml LPS共同作用)、白藜蘆醇中劑量+LPS組(10 μ mol/L白藜蘆醇+1 μ g/ml LPS共同作用)、白藜蘆醇高劑量+LPS組(20 μ mol/L 白藜蘆醇+1 μ g/ml LPS 共同作用)。

1.5 倒置相差顯微鏡觀察小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

取對數(shù)生長期的N9細(xì)胞接種于24孔板內(nèi),貼壁培養(yǎng)24 h,加藥處理48 h后,倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化,各組均取板孔正中視野進(jìn)行觀察。

1.6 小膠質(zhì)細(xì)胞釋放NO含量測定

Griess分析法測定細(xì)胞上清液中亞硝酸鹽含量,代表NO含量。取對數(shù)生長期的N9細(xì)胞,以5×105cells/ml接種于96孔板內(nèi),100μ l/well,細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24h,加藥處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h,取 上清 培養(yǎng)液 50 μ l,轉(zhuǎn)移到 96 孔板,與 50 μ l的 Griess試劑室溫下反應(yīng)10 min,570 nm處測定其吸光度值,計算上清液中NO2-含量。

1.7 免疫熒光法檢測cdk5蛋白表達(dá)

取對數(shù)生長期的N9細(xì)胞做細(xì)胞爬片,加藥處理繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,用4%多聚甲醛固定15 min,3%BSA封閉20 min,加入兔抗鼠cdk5多克隆抗體(1∶100)4℃過夜,加入Alexa Fluor標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶500),室溫孵育 2 h,抗熒光淬滅封片液封片;倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇與LPS對小膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響

本實驗首先采用XTT法分析白藜蘆醇和LPS在實驗條件下對細(xì)胞存活率的直接影響,以排除藥物的細(xì)胞毒性對模型的干擾。XTT法結(jié)果顯示,1μ g/ml LPS作用于N9細(xì)胞,與對照組相比,對細(xì)胞存活率無明顯影響;5～20μ mol/L濃度范圍內(nèi)的白藜蘆醇,與對照組比,細(xì)胞存活率差別不顯著(P＞0.05,表1)。提示此濃度范圍內(nèi)的白藜蘆醇對小膠質(zhì)細(xì)胞的毒性相對較低,可用于進(jìn)一步的實驗研究。因而以下試驗均在此藥物濃度范圍內(nèi)進(jìn)行。

Tab.1 Effects of resveratrol and LPS on the cell survival rate of N9 microglia cells(%)

2.2 倒置相差顯微鏡觀察小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

結(jié)果顯示:LPS(1μ g/ml)處理細(xì)胞48 h,與對照組相比,細(xì)胞由阿米巴樣或圓形轉(zhuǎn)變?yōu)楸馄綘睢⒍鄻O桿狀,細(xì)胞變得肥大,突起伸長。而中高濃度白藜蘆醇(10,20 μ mol/L)與LPS共同作用,對細(xì)胞活化形態(tài)有明顯影響,細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)到與對照組相同。

2.3 小膠質(zhì)細(xì)胞釋放NO含量

結(jié)果顯示:不同濃度白藜蘆醇(5,10,20 μ mol/L)單獨作用于小膠質(zhì)細(xì)胞,對于NO釋放沒有明顯影響(表2)。中高濃度白藜蘆醇(10,20 μ mol/L)作用于 LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞,可顯著抑制LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放NO(P＜0.01,表3)。

Tab.2 Effects of resveratrol on NO released into the supernatant in N9 cells(μ mol/L)

Tab.3 Effects of resveratrol on NO released into the supernatant in LPS-activated N9 cells(μ mol/L)

2.4 小膠質(zhì)細(xì)胞 cdk5蛋白表達(dá)

cdk5蛋白在正常N9細(xì)胞低表達(dá),陽性細(xì)胞胞質(zhì)呈綠色(圖1A);LPS激活后,N9細(xì)胞高表達(dá) cdk5蛋白,熒光強(qiáng)度增加,且細(xì)胞處于活化形態(tài)(圖1B);低濃度白藜蘆醇(5 μ mol/L)與LPS共同作用,對cdk5蛋白表達(dá)無明顯影響(圖 1C);中高濃度白藜蘆醇(10,20 μ mol/L)與LPS共同作用,可以明顯下調(diào)cdk5蛋白表達(dá),且細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)(圖1D、E,圖 1見彩圖頁Ⅱ)。

3 討論

N9小膠質(zhì)細(xì)胞株是來源于小鼠的細(xì)胞株,其表型與未活化狀態(tài)下小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞一致,可很好模擬原代小膠質(zhì)細(xì)胞的特性,該細(xì)胞株被廣泛應(yīng)用于研究小膠質(zhì)細(xì)胞的實驗?zāi)Ｐ汀Ｖ嗵?lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性桿菌胞壁外膜層的重要組分,在體內(nèi)和體外研究中被廣泛地用于激活小膠質(zhì)細(xì)胞。

白藜蘆醇(resveratrol,Res)是存在于虎杖等植物中的一種多酚類化合物,具有多方面藥理活性。早已有研究者報道白藜蘆醇具有神經(jīng)保護(hù)作用,但其作用機(jī)制尚未明確[1]。本實驗結(jié)果表明,LPS作用48 h后,小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,呈現(xiàn)典型的激活形態(tài),與之前的結(jié)果一致[2]。Res與LPS共同作用,能夠明顯抑制細(xì)胞形態(tài)的改變,證明其具有抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化的作用。

小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活能夠產(chǎn)生NO,而中樞神經(jīng)系統(tǒng)中過量的NO可通過氧化應(yīng)激、損傷膜性結(jié)構(gòu)等,導(dǎo)致神經(jīng)元壞死或凋亡[3]。有研究認(rèn)為白藜蘆醇能強(qiáng)烈抑制脂多糖激活的巨噬細(xì)胞生成NOS,明顯減低細(xì)胞胞漿內(nèi)iNOS蛋白和mRNA的水平[4]。本實驗結(jié)果表明,Res與LPS共同作用,能夠明顯抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化所釋放的NO。提示白藜蘆醇的神經(jīng)保護(hù)作用可能與抑制小膠質(zhì)細(xì)胞生成iNOS,減少NO釋放有關(guān)。

腦組織中細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase5,cdk5)屬于細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶(cdks)家族。已有實驗證實,cdk5抑制劑有神經(jīng)保護(hù)作用。而cdk抑制劑也能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活。據(jù)此,本實驗檢測了小膠質(zhì)細(xì)胞上cdk5表達(dá)情況。結(jié)果表明,LPS刺激小膠質(zhì)細(xì)胞會導(dǎo)致cdk5表達(dá)水平上升;而Res與LPS共同作用,則會顯著下調(diào)cdk5表達(dá)。這提示我們,Res抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化的作用可能與cdk5相關(guān)。然而其分子機(jī)制和途徑仍不明確。早有研究顯示腦組織中cdk5的活性受[Ca2+]i調(diào)節(jié),當(dāng)[Ca2+]i升高時cdk5的活性增加[5]。另有研究表明,Res能抑制大鼠海馬L-鈣通道,減少[Ca2+]i[6]。有關(guān) Res是否通過下調(diào)[Ca2+]i表達(dá)而減少cdk5,進(jìn)而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化起到保護(hù)作用,值得進(jìn)一步研究。

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[2]白群華,李文明,劉洪濤,等.葛根素對脂多糖誘導(dǎo)N9小膠質(zhì)細(xì)胞激活的抑制作用[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2010,26(3):227-230.

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