孕酮對缺氧缺血新生鼠腦皮質HIF-1α表達的影響*

白瑞櫻,劉雪琴,王 湜卿,李東亮△

(1.新鄉醫學院生理學與神經生物學教研室,河南 新鄉 453003;2.濟源職業技術學院護理系,河南 濟源 454650)

研究表明,孕酮(progesterone,PROG)不僅可以在神經系統中合成和分泌,而且能影響其結構和功能,被稱為“神經活性甾體”。本實驗室以往的工作[1]和Ishrat最新的數據[2]都表明,PROG在腦缺血損傷中有腦保護作用,然而PROG腦保護作用的分子機制和途徑尚不十分明了。缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)作為缺氧調節的重要因子,介導機體對缺氧缺血產生的適應性反應,能減輕神經損傷[3]。本文以缺氧缺血新生大鼠為研究對象,研究PR OG預處理對腦內HIF-1α表達的影響,進一步探討PROG神經保護作用的分子機制,試圖為臨床治療缺氧缺血性腦病提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

PROG(sigma公司,批號0130),實驗前溶于芝麻油配成0.5 mg/ml備用;Trizol(Invitroge公司);Taq酶(上海生物工程公司);HIF-1α多克隆抗體(博士德公司);通用型二步法免疫組化檢測試劑盒(PV-6001),DAB顯色系統(北京中杉試劑公司)。

1.2 動物分組及給藥方法

7日齡SD大鼠80只,雌雄不限,體重 11～16 g(新鄉醫學院實驗動物中心提供)。隨機分成4組(n=10):正常對照組,假手術組,缺氧缺血組和孕酮組。正常組不做任何處理,孕酮組動物于建立模型前30 min按8 mg/kg腹腔注射PROG液,其余各組注射等容積PROG溶劑芝麻油。

1.3 動物模型建立[4]

7日齡大鼠乙醚麻醉后,頸部正中切口,分離和結扎右頸總動脈后縫合切口。然后將動物置于37℃低氧箱內,以1.5 L/min的速度輸入80ml/L氧氣和920 ml/L氮氣,持續2 h,制備缺氧缺血模型。假手術組在頸部作一切口,僅分離右頸總動脈,不結扎,亦不予缺氧。

1.4 RT-PCR檢測大鼠皮質區 HIF-1α的 mRNA表達

假手術組、缺氧缺血組和孕酮組于術后24 h,正常組于相應時間點,斷頭取右腦皮質,用Trizol試劑提取總 RNA(測定A260/A280＞1.8),以Oligo為引物逆轉錄為cDNA,進行PCR擴增目的基因。所用引物根據GenBank上所查序列,通過Primer 5.0程序自行設計,引物序列為:HIF-1αF-Primer:5′

GGA AAG AAC AAA ACA CGC AG 3′,R-Primer:5′ TTC ACA CACACA ATG CACTG 3′;β-actinF-Primer:5′ ATG GAT GAC GAT ATC GCT GCG 3′,R-Primer:5′ TCG TCC CAG TTG GTG ACA ATG 3′,由上海生物工程公司合成。循環條件為95℃、5 min;94℃、30 s;60℃、50 s;72℃、30 s,共 30 個循環。PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳后,以Bander leader 3.0凝膠圖像處理軟件進行灰度分析,以目的基因與β-actin的擴增產物條帶灰度值之比作為反映目的基因mRNA水平的相對指標。

1.5 免疫組織化學檢測大鼠皮質區HIF-1α的蛋白表達

動物術后24 h,在乙醚麻醉下開胸,暴露心臟,右心耳開洞放血,同時經左心室插灌注針直升至主動脈,并滴注生理鹽水沖洗。繼之灌注4%多聚甲醛30 min,斷頭取腦,冠狀切取視交叉后2～4mm腦組織,置于4%多聚甲醛中固定4 h,常規梯度乙醇脫水、透明、包埋,連續冠狀切片(厚4～6 μ m)。3%H2O2室溫孵育10 min,微波抗原修復10 min,室溫冷卻2 h,正常血清封閉30 min,分別滴加一抗(兔抗大鼠HIF-1α多克隆抗體,1∶200),4℃過夜,加入通用型IgG抗體-HRP多聚體,37℃ 孵育30 min,DAB顯色8 min,脫水、透明、封片。每只動物取兩張腦組織切片,400倍光鏡下隨機選取兩個視野,用HMIAS-2000進行圖像分析,由計算機系統自動計算出平均光密度值(mean optical density,MOD)。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠皮質區 HIF-1α的mRNA表達

電泳條帶灰度掃描分析結果顯示,正常組、假手術組和缺氧缺血組皮質HIF-1αmRNA的表達無顯著性差異(P＞0.05),而HIF-1αmRNA表達在孕酮組最高,明顯高于正常組、假手術組和缺氧缺血組(P＜0.01,表1,圖1)。

Tab.1 Image analysis of the expression of HIF-1αmRNA in cerebral cortex(±s,n=10)

Tab.1 Image analysis of the expression of HIF-1αmRNA in cerebral cortex(±s,n=10)

HIF-1α:Hypoxia-inducible factor-1α;PROG:Progesterone**P＜0.01 vs normal-control group;##P＜0.01 vs sham-operated group;△△ P＜0.01 vs hypoxic-ischemic group

Group Ratio of gray scale Normal-control 0.52±0.05 Sham-operated 0.51±0.06 Hypoxic-ischemic 0.52±0.06 PROG 0.78±0.06**##△△

Fig.1 Expression of HIF-1αmRNA in cerebral cortex

2.2 各組大鼠皮質區 HIF-1α蛋白表達

HIF-1α陽性細胞分布在大腦皮質和海馬,胞核和胞漿均有表達,主要在胞核。正常對照組皮質區可見極少量HIF-1α表達,假手術組MOD值和正常對照組比較無顯著性差異(P＞0.05);缺氧缺血組皮質區HIF-1α表達增加,MOD值明顯大于正常對照組(P＜0.01);孕酮組MOD值不僅明顯高于正常對照組(P＜0.01),亦高于缺氧缺血組(P＜0.05,表2,圖2見彩圖頁Ⅴ)。

Tab.2 Image analysis of the protein expression of HIF-1α in cerebral cortex(±s,n=10)

Tab.2 Image analysis of the protein expression of HIF-1α in cerebral cortex(±s,n=10)

HIF-1α:Hypoxia-inducible factor-1α;PR OG:Progesterone**P＜0.01 vs normal-control group;#P＜0.05 vs hypoxicischemic group

Group MOD value Normal-control 0.21±0.03 Sham-operated 0.21±0.02 Hypoxic-ischemic 0.38±0.03**PROG 0.55±0.04**#

3 討論

缺氧誘導因子-1(HIF-1)廣泛參與哺乳動物細胞缺氧誘導產生的適應性反應,是機體細胞適應低氧的重要轉錄調節因子。HIF-1是由α和β兩個亞單位組成的異二聚體,細胞內的氧水平能夠調節HIF-1α亞單位的穩定性、定位和促進轉錄的功能,而β亞單位則在細胞核中持續表達,其活性不受氧的影響[3]。

本實驗結果顯示,正常對照組可見有HIF-1αmRNA的表達和極少量的HIF-1α蛋白的表達,與假手術組相比,無顯著性差異(P＞0.05),因而可以排除單純手術對實驗結果的影響。缺氧缺血組HIF-1αmRNA的表達與正常對照組和假手術組相比均無顯著性差異(P＞0.05),但缺氧缺血組HIF-1α蛋白表達卻增加,明顯高于正常對照組及假手術組(P＜0.01)。可見缺氧并未引起HIF-1αmRNA的明顯上調,但卻使HIF-1α蛋白表達明顯增加,表明缺氧不是在基因水平,而是在蛋白水平影響HIF-1α的表達。Liu等[5]在培養的新生鼠皮質神經元觀察到了缺氧損傷引起的結果,而我們在整體動物上加以驗證,細胞水平和整體水平獲得的結果相一致。為什么缺氧時HIF-1αmRNA無變化,而HIF-1α蛋白表達卻明顯增加呢?在氧濃度正常的情況下,HIF-1α亞單位泛素化并經泛素-蛋白酶小體途徑降解。而缺氧時脯氨酸羥化酶喪失功能,使HIF-1α不能被降解,并在核內聚集,最后與HIF-1β結合,識別缺氧反應靶基因啟動子上的缺氧反應元件(HREs),使其靶基因表達增強。也就是說HIF-1α蛋白遇氧分解;而缺氧缺血時HIF-1α蛋白降解受阻,從而致 HIF-1α蛋白增加,而 HIF-1α mR NA則并未改變。

被稱為“神經活性甾體”的PR OG,代謝產物具有麻醉,抗驚厥,抗焦慮和保護神經細胞的作用。本實驗室也已證實PROG可明顯減少大鼠缺血側腦組織紋狀體的鈣含量,減輕細胞“鈣超載”,起到對神經細胞的保護作用。也觀察到PROG可減輕新生鼠缺氧缺血性腦水腫[4]。且PROG可以通過上調葡萄糖轉運體的表達使腦內葡萄糖的轉運增加,以維持缺氧缺血腦組織的能量供給,從而發揮腦保護作用[1,5],而葡萄糖轉運蛋白也是HIF-1的靶基因。目前有報道,HIF-1α至少能調節70多個靶基因的表達:促進糖酵解代謝基因表達;促進葡萄糖轉運基因表達;影響內皮素-1等基因的表達。這些變化使細胞、組織發生適應性和保護性改變,以減輕缺氧缺血性損傷。我們的研究結果顯示,孕酮組大腦皮質HIF-1α在蛋白和mRNA表達水平均明顯高于缺氧缺血組,孕酮對新生鼠缺氧缺血性腦損傷的保護作用可能是通過其上調HIF-1α的表達實現的。由此我們推測,HIF-1可能在PROG介導缺氧缺血的腦保護作用中處于重要地位。或許這正是孕酮臨床防治缺氧缺血性腦病的價值所在。

[1]李東亮,趙紅崗,王東霞,等.孕酮對腦缺血再灌注大鼠紋狀體水,鈉,鉀及鈣含量的影響[J].中國病理生理雜志,2001,17(10):1012-1015.

[2]Ishrat T,Sayeed I,Atif F,et al.Effects of progesterone administration on infarct volume and functional deficits following permanent focal cerebral ischemia in rats[J].Brain Res,2009,1257:94-101.

[3]Chandel N S,Budinger G R.The cellular basis for diverse responses to oxygen[J].Free Radic Biol Med,2007,42(2):165-174.

[4]李 爽,徐春陽,姜洪波,等.孕酮對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦組織超氧化物歧化酶和基質金屬蛋白酶3表達的影響[J].實用兒科臨床雜志,2010,25(14):1056-1057.

[5]Liu J,Narasimban P,Yu F,et al.Neuroprotection by hypoxic preconditioning involves oxidative stress-mediated expression of hypoxia-inducible factor and erythropoietin[J].Stroke,2005,36(6):1264-1249.