皖南花豬不同發育階段脂肪組織脂聯素及受體和瘦素mRNA的變化*

盛 晟,周 杰,張 佳,邵 康,吳小雪,李維新,殷宗俊

(安徽農業大學動物科技學院,合肥 230036)

自從Scherer等1995年克隆了脂聯素(adiponectin,Adp)基因,并發現其表達產物是一個30 kDa的蛋白質,Zhang等1994年克隆了瘦素(leptin)基因,近十幾年的研究表明,脂肪細胞可分泌大量活性物質,通過內分泌、旁/自分泌的形式在能量調節中起重要作用。其中,Adp是唯一一種隨脂肪沉積增多其血液濃度反而下降的脂肪因子,Adp大約占血漿總蛋白的0.01%,是迄今發現的含量最豐富的脂肪因子[1]。Ding等2004年首次克隆了豬Adp基因片段,發現其主要在豬脂肪組織中高表達,并發現Adp有兩種受體,其中AdpR1在骨骼肌高表達,AdpR2在肝臟、脂肪高表達[2]。基因的表達具有時間特異性,然而目前有關Adp的研究一般集中在動物生長的某一階段,對不同發育階段Adp分泌變化的研究不多,且有不同的結果。本實驗室發現豬血液Adp有明顯的時序變化[3]。Ramsay等發現新生小豬(0～21d)脂肪組織Adp和leptin mRNA的表達隨日齡增加[4],而斷奶后Adp基因的表達規律未見報道。此外,配體的作用效果往往決定于其受體水平的變化。目前尚未見豬不同發育階段脂肪組織中AdpR表達的報道。本研究利用熒光定量PCR方法測定不同日齡皖南花豬皮下脂肪和內臟脂肪Adp、AdpR1、AdpR2和leptin mRNA的表達,系統認識它們的表達規律和性別差異。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集

從安徽黟縣皖南花豬繁育中心選擇0 d、30 d、45 d(斷奶)、90 d、180 d的健康皖南花豬雌、雄各5頭,常規飼養管理,屠宰前禁食12 h(0 d除外),正常飲水。屠宰后迅速采集豬皮下(subcutaneous,SC)和腎周(perirenal,PR)脂肪組織,液氮速冷后-80℃保存備用。

1.2 主要試驗儀器和材料

高速冷凍離心機(Sigma,德國),紫外分光光度計(島津,日本),PCR儀(Techne,英國),熒光定量PCR儀(Corbett,澳大利亞)。Trizol Reagent、鼠源反轉錄酶(M-MLV)、DNA 聚合酶、SYBR·Premix Ex TaqTMⅡ(大連寶生物);寡聚核苷酸(Oligo(dT)18)、dNTP、瓊脂糖 、焦碳酸二乙酯(DEPC)、DNA maker2000、0.5×TBE(上海生工生物)。

1.3 試驗方法

1.3.1 組織總RNA提取 按Trizol Reagent試劑盒要求提取樣品總RNA。OD260/OD280測定值在1.8～2.0為合格,根據OD260值計算RNA產量。甲醛變性凝膠電泳檢測RNA質量。

1.3.2 反轉錄 反應體系:總 RNA 2 μ l,Oligo dT Primer(20 μ mol/L)4 μ l,RTase M-MLV(200 U/μ l)1 μ l,5 ×M-MLV Buffer 4 μ l,dNTP Mixture(10mmol/L)1 μ l,Rnase Inhibitor(40 U/μ l)0.5 μ l,加 Rnase free ddH2O至 20 μ l。反應條件 :37℃15 min,85℃5 s。反轉錄獲得各樣品的cDNA以18S為引物,常規PCR反應鑒定純度。

1.3.3 引物設計 Adp、AdpR1、AdpR2、leptin 和內標β-actin引物序列根據GenBank中各基因的序列設計(表1)。

Tab.1 Primers used for real-time quantitative PCR

1.3.4 實時定量RCR反應 用待測樣品RT產物混合樣(cDNA mix)優化反應條件。反應體系:cDNA 2 μ l,SYBR·Premix Ex TaqTM(1×)12.5 μ l,上下游引物(10 μ mol/L)各 1 μ l,ddH2O 8.5 μ l,總體積 25 μ l。每個樣品設3個重復,熒光PCR擴增:95℃預變性2 min,95℃10 s,60℃20 s,72℃15 s,72℃收集熒光15 s,40個循環后,進行熔點曲線分析,判定反應特異性。

1.4 數據統計分析

2 結果

2.1 不同發育階段Adp及其受體和leptin基因表達的規律及組織差異

2.1.1 AdpmRNA表達規律 皮下脂肪和腎周脂肪Adp表達在不同發育階段有極顯著差異(P＜0.01),0 d低于其他日齡(P＜0.01,表2)。皮下脂肪Adp 90 d表達量最高,并與45 d、180 d差異顯著;腎周脂肪Adp表現為下降趨勢,30 d與180 d差異顯著。腎周脂肪Adp總體比皮下脂肪高62.1%(P＜0.05),并在30 d和45 d差異顯著。

2.1.2 AdpR1 mRNA表達規律 0～90 d皮下脂肪AdpR1表達豐富,顯著高于180 d。腎周脂肪AdpR1隨日齡增加出現先升后降趨勢,30 d、45 d表達量高于其他日齡(P＜0.05或P＜0.01,表2)。腎周脂肪AdpR1總體比皮下脂肪低49.8%(P＜0.01),并在0 d和90 d差異顯著。

2.1.3 AdpR2 mRNA表達規律 30 d和90 d皮下脂肪AdpR2表達高于其他日齡(P＜0.01,表2),在腎周脂肪的表達有先升高后降低的趨勢,45 d高于其他日齡(P＜0.01)。腎周脂肪AdpR2總體比皮下脂肪低87.6%(P＜0.01),并在45 d外的其他日齡差異顯著。

2.1.4 Leptin mRNA表達規律 皮下脂肪和腎周脂肪letpin mRNA表達在發育不同階段有差異(P＜0.01,表2),在皮下脂肪0 d表達高于其他日齡(P＜0.01),在腎周脂肪隨日齡增加而減少,總體上在腎周脂肪顯著低于皮下脂肪(P＜0.05)。

Tab.2 Changes in the mRNA expression of Adp,AdpR1,AdpR2 and leptin in SC and PR of Wannanhua pigs at different stages of development(±s,n=10)

Tab.2 Changes in the mRNA expression of Adp,AdpR1,AdpR2 and leptin in SC and PR of Wannanhua pigs at different stages of development(±s,n=10)

Adp:Adiponectin;AdpR1:Adiponectin receptor 1;AdpR2:Adiponectin receptor 2;SC:Subcutaneous adipose tissue;PR:Perirenal adipose tissue*P＜0.05 vs SC;#P＜0.05,##P＜0.01 vs 0 d;△P＜0.05,△△P ＜0.01 vs 30 d;▲P＜0.05,▲▲P＜0.01 vs 45 d;○P＜0.05 vs 90 d

Item Tissue Age 0 d 30 d 45 d 90 d 180 d Adp SC 0.005±0.001 1.000±0.422 0.464±0.075# 1.492±0.160#▲ 0.740±0.349#○PR 0.014±0.011 2.140±0.617*## 1.569±0.258*## 1.286±0.327## 0.993±0.240##△△▲▲AdpR1 SC 1.039±0.248 1.000±0.423 0.590±0.183 1.083±0.132 0.307±0.111#△PR 0.305±0.101* 0.716±0.105## 0.585±0.112## 0.205±0.044*△△▲▲ 0.240±0.049△△▲▲AdpR2 SC 0.093±0.015 1.000±0.179# 0.260±0.060△ 0.642±0.141#△▲ 0.269±0.084△PR 0.017±0.001* 0.049±0.014* 0.145±0.039##△△ 0.038±0.009*▲▲ 0.036±0.009*▲▲Leptin SC 9.264±3.682 1.000±0.260# 0.824±0.467# 1.432±0.906# 0.432±0.198#PR 2.764±0.527 1.830±0.603 0.742±0.294##△△ 0.257±0.073##△△ 0.183±0.045##△△

2.2 皮下脂肪和腎周脂肪基因表達的性別差異

不同發育階段雄、雌性豬脂肪組織各基因表達的變化沒有總體差異,只有0 d雄性豬皮下脂肪AdpR2 mRNA高于雌性(0.116±0.008vs0.061±0.018,P＜0.05),內臟脂肪leptin低于雌性(1.559±0.126vs3.473±0.651,P＜0.05);90 d雄性豬內臟脂肪Adp高于雌性(1.803±0.451vs0.635±0.179,P＜0.01),AdpR1和 leptin分別高于雌性(0.274±0.060vs0.118±0.028;0.402±0.105vs0.118±0.053,P＜0.05)。雄、雌性豬皮下脂肪各基因表達與腎周脂肪的差異與雌雄合計時的情況一致。

2.3 相關性分析結果

皮下脂肪和腎周脂肪Adp mRNA的表達分別與同組織中AdpR1、AdpR2呈極顯著或顯著正相關(P＜0.01,P＜0.05,表3);分別與同組織leptin呈顯著負相關(P＜0.05)。皮下和腎周脂肪Adp mRNA的表達顯著相關(P＜0.05)。

Tab.3 Correlation coefficients between Adp,AdpR1,AdpR2 and leptin mRNA expression in SC and PR

此外,皖南花豬30 d、45 d、90 d和180 d 時6、7肋背部皮下脂肪厚度分別為(cm):0.37±0.03、0.52±0.04、0.70±0.02和 1.02±0.10(0 d未測定到結果)。除0 d外,內臟脂肪Adp和AdpR1 mRNA分別與皮下脂肪厚度呈負相關(r=-0.346,P＜0.05;r=-0.505,P＜0.01),皮下脂肪AdpR2mRNA與皮下脂肪厚度呈負相關(r=-0.389,P＜0.05)。

3 討論

早期的內分泌作用可以影響遺傳性狀,并隨年齡增長而逐漸顯現,這種作用往往表現為滯后效應,稱為程序化(Gardner et al,2009)。所以,研究Adp及其受體的發育性變化規律十分重要。本試驗發現豬在0 d時脂肪組織Adp表達量極低,這可能與豬剛出生時前體脂肪細胞較多,而成熟脂肪細胞相對較少有關(K?rner et al,2005)。本試驗發現豬0～30 d脂肪Adp mRNA水平均隨日齡升高,與Ramsay等的結果一致[4];30～180 d內臟脂肪Adp mRNA表達呈下降趨勢,與皮下脂肪厚度呈負相關,與在人及嚙齒類報道的Adp隨脂肪沉積增多而下降的結果一致[1],結果提示Adp在豬的作用可能與在人及嚙齒類的類似,也與能量代謝有關。而皖南花豬皮下脂肪letpin mRNA在0 d表達豐富,與我們以往在太湖豬和大白豬的研究結果不同[5]。這是否與動物的品種有關,有待進一步研究。

本實驗發現雌、雄性皖南花豬在發育過程中,內臟脂肪Adp mRNA表達在總體上均顯著高于皮下脂肪,與Lord等在110 kg體重雌性豬[6]、成年雌、雄性小鼠[7]、成年大鼠實驗(Altomonte et al,2003)中的報道一致,提示內臟脂肪表達的Adp可能是血液Adp的主要來源。皖南花豬AdpR1、AdpR2以及 letpin mRNA表達量的組織差異與Adp相反,腎周脂肪AdpR1和AdpR2 mRNA在總體上均極顯著低于皮下脂肪,且雌、雄性豬結果一致,與Ramsay等對哺乳期仔豬和斷奶后豬的研究結果一致[4,7]。

本實驗中雌、雄性豬Adp mRNA在總體上沒有明顯差異,但在180 d時(性成熟)雌性豬皮下脂肪和內臟脂肪Adp mRNA表達量分別高于雄性豬,雖然未到達顯著水平,與小鼠的研究相似[8,9],結果提示Adp可能與雌、雄個體性成熟后脂肪沉積的差異有關。

本實驗發現皖南花豬除0 d外,內臟脂肪Adp與皮下脂肪厚度呈負相關,與梅山豬的情況相似。內臟脂肪AdpR1 mRNA,皮下脂肪AdpR2 mRNA分別與皮下脂肪厚度呈負相關,與Lord等[6]的結果有一定差異。結果提示脂聯素及受體表達與脂肪沉積的關系存在品種差異。

綜上所述,皖南花豬不同發育階段脂肪組織中Adp及受體和leptin mRNA的表達均有一定的變化規律,且有組織特異性,其中Adp mRNA的表達量在內臟組織高于皮下脂肪,而AdpR1、AdpR2和leptin mRNA的表達量在內臟組織低于皮下脂肪。Adp與其受體mRNA表達有相關性。

[1]Arita Y,Kihara S,Ouchi N,et al.Paradoxical decrease of an adipose-specific protein,adiponectin,in obesity[J].Biochem BiophysResCommun,1999,257(1):79-83.

[2]Ding S T,Liu B H,Ko Y H.Cloning and expression of porcine adiponectin and adiponectin receptor 1 and 2 genes in pigs[J].J Anim Sci,2004,82(11):3162-3174.

[3]盛 晟,周 杰,舒寶屏,等.皖南花豬11種血液生化指標的發育性變化及性別差異[J].生命科學研究,2010,14(2):150-155.

[4]Ramsay T G,Caperna T J.Ontogeny of adipokine expression in neonatal pig adipose tissue[J].Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol,2009,152(1):72-78.

[5]Zhou J,Zhao R,Wei X,et al.Developmental patterns of serum leptin levels,leptin gene expression in adipose tissue and Ob-Rb gene expression in hypothalamus of Erhualian and Large White pigs[J].Sci China C Life Sci,2004,47(2):190-196.

[6]Lord E,Ledoux S,Murphy B D,et al.Expression of adiponectin and its receptors in swine[J].J Anim Sci,2005,83(3):565-578.

[7]Ramsay T G,Richards M P.Leptin and leptin receptor expression in skeletal muscle and adipose tissue in response toin vivoporcine somatotropin treatment[J].J Anim Sci,2005,83(11):2501-2508.

[8]Combs T P,Berg A H,RajalaM W,et al.Sexual differentiation,pregnancy,calorie restriction,and aging affect the adipocyte-specfic secretory protein adiponectin[J].Diabetes,2003,52(2):268-276.

[9]Gui Y,Silha JV,Murphy L J.Sexual dimorphism and regulation of resistin,adiponectin,and leptin expression in the mouse[J].Obes Res,2004,12(9):1481-1491.