替米沙坦及吡哆胺對自發性高血壓大鼠腦組織氧化應激的影響*

黃 峰,朱鵬立△,林 帆,林 虹

(1.福建省立醫院干部特診科,2.福建醫科大學,福州 350001)

高血壓是一種嚴重危害人類健康的常見病、多發病,造成心、腦、腎等靶器官的損傷。臨床及流行病學研究均證實,長期的高血壓所致的腦損傷造成認知功能的逐漸下降[1,2],氧化應激與高血壓密切相關[3]。替米沙坦是特異性血管緊張素Ⅱ Ⅰ型受體拮抗劑,它的降壓作用已得到公認,而吡哆胺是強效的抗氧化劑。本研究以自發性高血壓模型鼠為研究對象,通過替米沙坦及吡哆胺單獨及聯合治療,觀察干預前后高血壓大鼠腦組織中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamid adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶p47phox mRNA表達、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)水平的變化,探討替米沙坦及吡哆胺對自發性高血壓大鼠腦組織氧化應激狀態的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及干預措施

22周齡雄性SPF級別自發性高血壓大鼠(spon-taneously hypertensive rat,SHR)24只,22周齡雄性SPF級別維斯塔京都大鼠(wistar-kyoto rats,WKY)6只,均購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。實驗動物適應性喂養兩周后,24只SHR隨機分為4組(n=6):高血壓對照組(hypertension control,HC)每天用蒸餾水2 ml灌胃1次;替米沙坦組(telmisartan,T)每天用6 mg/kg[4]的替米沙坦灌胃1次;吡哆胺組(pridoxamine,P):每天用200 mg/kg[5]的鹽酸吡哆胺灌胃1次;聯合治療組(telmisartan and pridoxamine TP):每天用6 mg/kg的替米沙坦加上200 mg/kg的鹽酸吡哆胺灌胃1次。WKY作為正常對照組(normal control,NC)每天用蒸餾水2 ml灌胃1次。替米沙坦(Telmisartan)商品名:美卡素,80毫克/片,德國勃林格殷格翰藥業有限公司生產,國藥準字:H20041746。鹽酸吡哆胺(Pridoxamine)美國BIOFER公司產品,貨號:09548CAS-NO:524-367。實驗干預16周。

1.2 收縮壓測定

各組大鼠每兩周測一次尾動脈收縮壓、體重直至實驗結束。血壓的測量方法:采用智能無創血壓計BP-98A(日本軟隆株式會社),在大鼠清醒狀態將大鼠放入鼠袋中,保持恒溫,將感應器置于大鼠的尾根部,待大鼠安靜后測量尾動脈的收縮壓,取測量三次的平均值為收縮壓的結果。

1.3 實驗標本的采集和處理

各組大鼠實驗結束時,分別稱體重,測尾動脈收縮壓,用10%的水合氯醛溶液0.30 ml/100g腹腔麻醉,固定于蛙板上,斷頭取腦,將大腦組織縱向切開,取左側大腦組織用生理鹽水沖洗,100 mg腦組織置于液氮中保存,備檢NADPH氧化酶p47phox mRNA水平,100 mg腦組織-80℃保存,備檢MDA含量及SOD活性。

1.4 腦組織 MDA、SOD檢測

MDA含量用硫代巴比妥酸法測定,SOD活性用黃嘌呤氧化酶法測定,具體操作按試劑盒說明進行。考馬斯亮藍法測定蛋白含量。試劑盒購自南京建成生物醫學工程所。

1.5 腦組織中NADPH氧化酶p47phox mRNA表達的檢測

取腦組織100 mg左右,采用經典方法用Trizol試劑、氯仿和異丙醇進行抽提mRNA。按反轉錄試劑盒(DRR037A Takara公司)的說明進行反轉錄,反應體系 20 μ l,條件為 37℃,15 min,反轉錄反應;85℃,5 s,加熱使反轉錄酶失活,反應結束后,將cDNA保存于4℃。使用SYBR Premix Ex Taq TM II試劑盒(DRR081A,TaKaRa)在Thermal Cycler Dice Real Time System(TP800,TaKaRa)中進行實時熒光定量PCR(Real Time PCR RT-PCR)。反應條件:stage1:預變性(Repeat 1):95℃,30 s。Stage 2:PCR反應(Repeat 40):95℃,5 s;60℃,30 s(熒光信號采集)。Stage 3:融解曲線分析(Repeat 1):95℃,15 s;60℃,30 s;95℃,15 s(熒光信號采集)。采用雙標準曲線法求出初始模板量,根據公式(目的基因的表達量=目的基因定量結果/管家基因定量結果)計算在腦組織中通過管家基因(β-actin)得出的目的基因NADPH氧化酶p47phox的表達量,進行組間比較。從Genbank查獲目的基因NADPH氧化酶p47phox及管家基因β-actin mRNA序列及其登錄號,Real Time PCR引物的設計與合成均由大連寶生物公司完成,引物序列見表1。

Tab.1 Sequences for primers

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 藥物干預前后大鼠血壓和體重情況

實驗過程死亡2只大鼠,故NC組、HC組、T組、P組、TP 組最終分別存活6只、6只、5只、6只、5只。HC組、T組、P組、TP組血壓均明顯高于NC組(P＜0.01);HC組、T組、P組、TP組之間血壓無統計學差異(P＞0.05)。5組大鼠之間體重無明顯統計學差異(P＞0.05)。說明選擇動物符合實驗要求。藥物干預16周后,HC組大鼠血壓仍然明顯高于NC組(P＜0.01);T組、TP組在干預16周后與HC組比較血壓有明顯下降(P＜0.01),但T組與TP組之間血壓無統計學差異(P＞0.05);P組血壓未見下降,仍明顯高于NC組(P＜0.01),P組與HC組比較血壓無明顯差異(P＞0.05,表2);干預治療16周后,各組體重之間無明顯統計學差異(P＞0.05,表2)。說明替米沙坦可以顯著降低SHR的血壓,吡哆胺無降壓作用,兩者聯合治療未見協同降壓作用。替米沙坦和吡哆胺不影響大鼠體重。

Tab.2 Blood pressure and weight before and after interference(±s,n=5～ 6)

Tab.2 Blood pressure and weight before and after interference(±s,n=5～ 6)

BP:Blood pressure;NC:Normal control;HC:Hypertension control;T:Telmisartan;P:Pridoxamine;TP:Telmisartan and pridoxamine**P＜0.01 vs NC group;# #P＜0.01 vs HC group

Before After Group Systolic BP Weight Systolic BP Weight(mmHg) (g) (mmHg) (g)NC 128.92±5.88 369.25±25.84 122.05±7.29 388.33±22.89 HC 193.50±13.03** 380.00±20.30 193.66±17.72** 393.50±13.63 T 192.42±13.28** 383.10±28.53 99.80±13.28## 393.40±22.62 P 192.67±12.98** 375.08±23.20 195.37±12.98** 390.67±18.31 TP 192.58±14.66** 365.80±20.54 97.00±14.66## 380.70±28.86

2.2 各組大鼠SOD、MDA含量檢測結果

與NC組比較,HC組腦組織中MDA含量明顯升高、SOD活性明顯減低(P＜0.05);與HC組比較T組、P組、TP組MDA含量明顯減低,SOD活性明顯升高(P＜0.05);MDA含量及SOD活性TP組與T組之間無統計學差異(P＞0.05);MDA含量TP組明顯低于P組,SOD活性TP組比P組明顯增高(P＜0.05,表3)。說明SHR腦組織中MDA含量升高、SOD活性降低;替米沙坦及吡哆胺治療可以抑制此改變,聯合治療組在降低MDA含量提高SOD活性方面并不優于替米沙坦單藥治療組,但優于吡哆胺單藥治療組。

Tab.3 Results of MDA level,SOD activity(±s,n=5～ 6)

Tab.3 Results of MDA level,SOD activity(±s,n=5～ 6)

MDA:Malondialdehyde;SOD:Superoxide dismutase;NC:Normal control;HC:Hypertension control;T:Telmisartan;P:Pridoxamine;TP:Telmisartan and pridoxamine*P＜0.05 vs NC group;#P＜0.05 vs HC group;△P＜0.05 vs TP group

Group MDA(nmol/L) SOD(U/mg)NC 25.86±3.28 288.94±6.71 HC 57.34±2.49* 198.04±15.56*T 37.69±1.07# 245.85±12.63#P 31.84±1.99#△ 231.83±8.49#△TP 25.86±3.28# 267.57±15.95#

2.3 各組大鼠NADPH氧化酶p47phox mRNA表達量檢測結果

實時熒光定量PCR檢測結果顯示管家基因(βactin基因)和目的基因(NADPH氧化酶p47phox基因)都得到較好的標準曲線、擴增曲線和融解曲線。各組NADPH氧化酶p47phox mRNA的表達量見圖4。與NC組比較HC組NADPH氧化酶p47phox mRNA表達顯著上調(P＜0.01);與HC組比較T組和TP組NADPH氧化酶p47phox mRNA表達明顯下調(P＜0.01),HC組與P組比較NADPH氧化酶p47phox mRNA表達無統計學差異(P＞0.05,圖1)。說明SHRNADPH氧化酶p47phox mRNA表達增加,替米沙坦可以顯著抑制NADPH氧化酶p47phox mRNA表達水平,但吡哆胺不能抑制NADPH氧化酶p47phox mRNA的表達。

Fig.1 NADPH p47phox mRNA relative quantity

3 討論

3.1 氧化應激與高血壓腦損傷

大量研究表明氧化應激在原發性高血壓的發生和發展過程中起著重要的作用[3]。活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)是與氧化應激密切相關自由基。NADPH氧化酶p47phox的激活是ROS的主要來源[6]。SOD活力和MDA含量的可間接反應自由基代謝水平[7]。本文觀察到SHR腦組織中MDA含量顯著升高,SOD活性明顯降低,提示自發性高血壓大鼠腦組織自由基生成增加,清除自由基的抗氧化防御能力下降,腦組織的氧化應激反應增強,氧化應激反應增強可能是高血壓腦損傷的機制之一。

3.2 替米沙坦對腦損傷的保護作用

替米沙坦是一種特異性血管緊張素Ⅱ Ⅰ型受體拮抗劑(angiotensinⅡ typeⅠ receptor antagonist,ARB),其降壓作用已得到公認,替米沙坦是否有降壓以外的靶器官保護作用。研究結果表明,當ARB與血管緊張素Ⅱ Ⅰ型受體(angiotensinⅡtypeⅠreceptor,AT1)結合,阻斷血管緊張素Ⅱ(angiontensinⅡ,AngⅡ)與AT1受體結合,降低NADPH氧化酶的活性[8],減少氧化應激反應。本實驗選用替米沙坦作為干預藥物,觀察其對腦組織MDA、SOD及NADPH氧化酶p47phox mRNA表達的影響。實驗結果表明,替米沙坦治療組血壓明顯下降,并降低腦組織MDA的濃度、提高腦組織SOD活性及抑制NADPH氧化酶p47phox mRNA表達,說明替米沙坦在降低血壓的同時可以抑制高血壓腦組織的氧化應激狀態,其可能機制是通過阻斷腎素血管緊張素系統而抑制NADPH氧化酶p47phox mRNA的表達,提示替米沙坦可能具有降壓以外的靶器官保護作用。

3.3 吡哆胺對腦損害的保護作用

吡哆胺是維生素B6三種天然形式之一,Mahfouz等研究證明,在體外培養內皮細胞暴露在自由基中可導致超氧陰離子和脂質過氧化物水平的升高,吡哆胺作為抗氧化劑可減低超氧陰離子和脂質過氧化物水平的升高[9],因此吡哆胺是一種自由基清除劑。本研究結果提示,吡哆胺并不能降低SHR的血壓水平,可以降低腦組織中MDA濃度和增加SOD活性,但不影響腦組織中NADPH氧化酶p47phox mRNA的表達。提示吡哆胺無降壓作用但可通過清除自由基改善SHR腦組織的氧化應激狀態。

3.4 聯合治療對腦損害的保護作用

單獨使用替米沙坦和吡哆胺均能改善自發性高血壓大鼠腦組織的氧化應激狀態,聯合治療進一步探討自發性高血壓大鼠在降壓治療同時加用抗氧化劑是否能進一步改善腦組織氧化應激狀態。本研究結果表明,替米沙坦和吡哆胺聯合治療在增加SOD活力、降低MDA含量方面優于吡哆胺單藥治療,但與替米沙坦單藥治療組比較聯合治療組并沒有進一步改善腦組織氧化應激狀態。替米沙坦組和聯合治療組在干預后血壓均明顯下降,而吡哆胺組無降壓作用。說明降壓治療是改善自發性高血壓大鼠的血壓腦組織大氧化應激狀態的關鍵。高血壓腦損害機制復雜,加用抗氧化劑吡哆胺未能表現出明顯的協同改善高血壓腦組織氧化應激的作用,其具體機制值得我們進一步研究。

[1]Ueno M,Sakamoto H,Tomimoto H,et al.Blood brain barrier is impaired in the hippocampus of young adult spontaneously hypertensive rats[J].Acta Neuropathol,2004,107(6):532-538.

[2]Rigaud A S,Seux M L,Staessen JA,et al.Cerebral complications of hypertension[J].J Hum Hypertens,2000,14(10-11):605-616.

[3]Puddu P,Puddu G M,Cravero E,et al.The molecular sources of reactive oxygen species in hypertension[J].Blood Press,2008,17(2):70-77.

[4]Li YQ,Ji H,Zhang Y H,et al.Metabolic effects of telmisartan in spontaneously hypertensive rats[J].Naunyn SchmiedebergsArch Pharmacol,2006,373(4):264-270.

[5]Kakuta T,Tanaka R,Satoh Y,et al.Pyridoxamine improves functional,structural,and biochemical alterations of peritoneal membranes in uremic peritoneal dialysis rats[J].Kidney Int,2005,68(3):1326-1336.

[6]Li J M,Mullen A M,Yun S,et al.Essential role of the NADPH oxidase subunit p47(phox)in endothelial cell superoxide production in response to phorbol ester and tumor necrosis factor-alpha[J].Cric Res,2002,90(2):143-150.

[7]郭 勇,蔣電明,袁 新.股骨頭缺血性壞死與氧化應激的臨床研究[J].重慶醫學,2008,18(37):2079-2080.

[8]趙 麗.AngⅡ介導的高血壓炎癥反應機制[J].高血壓雜志,2005,9(13):533-536.

[9]MahfouzM M,Zhou S Q,Kummerow F A.Vitamin B6 compounds are capable of reducing the superoxide radical and lipid peroxide levels induced by H2O2 in vascular endothelial cells in culture[J].Int J Vitam Nutr Res,2009,79(4):218-229.