下肢骨骼肌缺血后處理對兔缺血/再灌注心肌壞死和凋亡的影響*

任慧敏,謝瑞芹,崔 煒,劉 凡,劉 靜,呼海娟,魯靜朝

(河北醫科大學第二醫院心內科,石家莊 050000)

心肌缺血/再灌注損傷是臨床上比較常見的病理生理過程,因其較大的影響了再灌注的治療效果,而受到人們越來越多的關注。1986年,Murry等[1]首次提出缺血預處理(ischemic preconditioning,IPC)能減輕后續長時間缺血/再灌注所引起的心肌損傷,認為是一種有效的機體保護機制,并且已在多種動物試驗模型中得到證實。然而,由于心肌缺血發生時間的不可預知性,缺血預處理在臨床中的應用受到了極大限制。后來,Zhao等學者[2]提出缺血后處理(ischemic-postconditioning),并證明其與預處理有著相似的心臟保護作用。近年來,有學者提出了遠端缺血后處理的概念,并進行了一系列的研究,但骨骼肌缺血后處理對兔心肌缺血/再灌注壞死和凋亡的研究目前報道較少,本實驗預對此進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

雄性新西蘭大白兔,體重2 500～3 000 g,由河北醫科大學動物中心提供。隨機分3組:假手術組(Sham):僅開胸暴露心臟,左冠狀動脈左室支中點處穿線,不結扎;缺血/再灌注組(ischemia/reperfusion,I/R):左冠狀動脈左室支阻斷45 min后,開放再灌注120 min;遠端后處理組(remote postcondationing,RPostC):在冠脈缺血/再灌注39 min時采取雙下肢髂外動脈閉塞5 min,在心肌再灌注前1 min結束雙下肢后處理,心肌再灌注120 min。

1.2 主要試劑

Tunel試劑盒(南京建成生物工程研究所),Caspase-3兔免疫組化試劑盒(北京博奧森生物科技有限公司),一抗Bcl-2,Bax兔抗IgG多克隆抗體(博士德生物技術有限公司),SP9001試劑盒及DAB顯色試劑盒(北京中杉生物科技有限公司),肌酸激酶試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司),乳酸脫氫酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)。其余均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 心肌缺血/再灌注模型建立 以3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)耳緣靜脈注射麻醉,氣管插管,接小動物呼吸機,用針形電極記錄標準肢體導聯心電圖。在胸骨左緣3～5肋間開胸,暴露心臟。選擇左室支在左心耳下緣與心尖連線的中點穿線備用,硅膠管套線,束緊后在貼近硅膠管的上端用止血鉗將線夾緊,造成心肌缺血。結扎成功標準是心電圖導聯ST抬高,結扎冠脈遠端心肌變紫。再灌注成功時變紫心肌恢復紅潤。

1.3.2 雙下肢骨骼肌缺血/再灌注模型建立 在心肌缺血/再灌注模型制備之前,采用2%利多卡因局麻雙側腹股溝區,直視下分離雙側髂外動脈。應用動脈夾夾閉髂外動脈固定位置以阻斷血流,以動脈搏動消失及恢復反映下肢缺血/再灌注情況。

1.3.3 心肌缺血區、壞死區范圍的檢測 于再灌注末在原位重新結扎左室支,從頸靜脈注入5%伊文思蘭4 ml,取下心臟,游離左心室,-20℃冷凍20 min固定心臟;將心臟沿著左心室(LV)長軸均勻切為厚約2 mm的心肌8～9片。再分離無藍染的缺血區(ischemic zone,IZ)和藍染的非缺血區并照像。將心肌置于 1%TTC磷酸緩沖液中37℃孵育 10～15 min,可將灰白色的壞死區(necrotic zone,NZ)和深紅色的非壞死區分開,照相后分離缺血區、非缺血區及缺血區內的壞死區和非壞死區,將分離好的心肌用濾吸紙吸干后分別稱重,并通過圖像處理軟件(Photoshop及image-Pro Plus圖像處理系統)計算各部分面積。以重量和面積兩種計量單位評價心肌缺血及壞死程度(缺血程度:缺血區重量/左室重量 ,以IZ/LVg表示,缺血區面積/左室面積 以IZ/LVs表示;壞死程度:壞死區重量/缺血區重量以NZ/IZg表示,壞死區面積/缺血區面積以NZ/IZs表示)。

1.3.4 血清心肌酶的測定 分別于結扎冠脈前、缺血45 min、再灌注60 min、120 min由頸動脈抽血 2 ml,2 500 r/min,離心20 min分離血清,-80℃保存待測。分別檢測血清磷酸肌酸酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)。

1.3.5 凋亡心肌細胞檢測 用Tunel法,即末端脫氧核苷酸轉移酶介導的生物素(dUTP)切口末端標記法(terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay,TUNEL assay)。于再灌注末,取缺血區心肌。組織大小為1 cm×1 cm×0.5 cm。取材后立即放人4%多聚甲醛液固定。用二甲苯常規脫蠟,梯度酒精入水重新水合,然后置PBS中5～10 min。TUNEL法標記程序嚴格按試劑盒方法進行。最后用蘇木精復染,常規脫水、透明、封片,顯微鏡觀察結果。凋亡細胞細胞核呈棕褐色或棕黃色顆粒為Tunel陽性反應。獨立取5個高倍鏡視野,計數凋亡細胞數和細胞總數。凋亡細胞指數=(凋亡細胞數/細胞總數)×100%。

1.3.6 免疫組化法測caspase-3、Bcl-2及Bax的表達于再灌注末,取相應缺血區心肌組織用4%多聚甲醛液固定。脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋。石蠟切片常規脫蠟至水,3%雙氧水孵育,微波抗原修復,正常山羊血清封閉,依次分別滴加1∶200抗兔caspase-3抗體,1∶100抗兔Bcl-2抗體及1∶100抗兔Bax抗體。生物素化二抗,SP復合物,DAB顯色,復染,脫水,透明,中性樹膠封片。計算caspase-3的表達,于每張玻片上隨機選取5個區域,每個區域計數100個細胞中的陽性細胞數。計算Bcl-2及Bax的表達通過CIAS-1000型計算機圖像分析系統,每張切片隨機選10個視野,分別測定每組Bcl-2、Bax細胞陽性染色的平均光密度(OD值)與陽性細胞百分比,計算蛋白陽性表達指數(PEI),PEI=OD值×陽性細胞百分比×100,并計算Bax與Bcl-2的比值。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 血流動力學指標

3組動物在缺血前、缺血后45 min及再灌注60 min、120 min時的心率(HR)和平均動脈壓(MAP)。

各組間HR和MAP在冠狀動脈缺血前差異無統計學意義。在冠狀動脈缺血期間,各組試驗動物的MAP呈下降趨勢,但是這種變化無統計學差異(表1)。

Tab.1 Hemodynamics during ischemia and reperfusion in three groups(±s,n=6)

Tab.1 Hemodynamics during ischemia and reperfusion in three groups(±s,n=6)

Isch45 min:End of 45 min LCX occlusion;R60 min:60 min after reperfusion;R120 min:120 min after reperfusion;HR:Heart rate;MAP:Mean arterial blood pressure;I/R:Ischemia/reperfusion;Rpost C:Remote postconditioning

Group Base Isch45 min R60 min R120 min HR(b/min)Sham 220±26 224±30 230±27 216±21 I/R 245±33 226±47 232±32 224±29 RpostC 233±16 221±16 228±13 235±12 MAP(mmHg)Sham 80±12 79±5 83±7 90±9 I/R 78±10 69±5 78±14 78±13 RpostC 83±5 80±7 90±10 93±8

2.2 心肌缺血和壞死范圍的測定

缺血/再灌注組與遠端后適應組W、LV及左室支結扎所造成的心肌缺血程度之間無統計學意義。遠端后適應組與缺血/再灌注組相比能夠顯著減少壞死程度:RPostC:NZ/IZg 19.4%±5.6%、NZ/IZs 17.11%±7.74%vsI/R:NZ/IZg 35.9%±6.3%、NZ/IZs 33.46%±8.05%(P＜0.05,表2)。

Tab.2 Comparison of W、LV and IZ/LV(%)、NZ/IZ(%)among three groups(±s,n=6)

Tab.2 Comparison of W、LV and IZ/LV(%)、NZ/IZ(%)among three groups(±s,n=6)

W:Weight;LV:Left ventricular mass;IZ:Ischemic zone;NZ:Necrotic zone;g:Gravity;s:Square metre*P＜0.05 vs I/R

Group W(Kg) LV(g) IZ/LV(g) IZ/LV(s) NZ/IZ(g) NZ/IZ(s)Sham 2.70±0.13 3.16±0.08 0 0 0 0 I/R 2.69±0.09 3.21±0.15 33.7±5.6 38.2±7.1 35.9±6.3 33.46±8.05 RpostC 2.73±0.16 3.19±0.23 31.5±3.7 36.7±4.8 19.4±5.6* 17.11±7.74*

2.3 血清CK和LDH的測定

各組動物缺血前、缺血后、再灌注60 min及再灌注120 min測得血清CK及LDH。各組缺血前CK及LDH均無差異。RPostC較缺血/再灌注組能夠減少再灌注120 min末CK釋放RPostC:CK 3997±865 U/LvsI/R:CK 6885±1202 U/L(P＜0.05),但LDH未顯示統計學差異(表3)。

Tab.3 Comparison of CK(U/L)and LDH(U/L)among three groups(±s,n=6)

Tab.3 Comparison of CK(U/L)and LDH(U/L)among three groups(±s,n=6)

*P＜0.05 vs I/R;#P＜0.05 vs sham

Group Base Isch45 min R60 min R120 min CK(U/L)Sham 1810±451 1759±450 1880±562 1785±490 I/R 1804±499 2050±591 3833±894 6885±1202 RpostC 1839±661 1982±725 3114±7883997±865*LDH(U/L)Sham 186±67 189±44 181±42 180±47 I/R 165±85 185±100 274±102 324±89#RpostC 195±79 226±88 252±70 294±95#

2.4 HE染色結果

Sham組心肌細胞大小形態無變化,橫紋清晰,胞核正常,只有少數區域間質充血。I/R組心肌細胞體積明顯增大、水腫,廣泛空泡變性。胞漿染色淡。少數區域的心肌纖維斷裂;胞核明顯增大,染色淺;間質充血、水腫,血管明顯擴張。RPostC組的心肌細胞體積略增大,少數細胞內空泡變性;胞漿染色較正常略淡,心肌橫紋局灶性消失,胞核小、染色無明顯變化,心肌細胞染色較I/R組深,部分區域間質充血,少數區域血管周圍有炎性細胞滲出(圖1)。

2.5 Tunel檢測結果

凋亡細胞的細胞核呈Tunel陽性反應,為棕褐色或棕黃色顆粒(圖2)。假手術組兔心肌組織只有少量凋亡細胞,缺血/再灌注組缺血區出現大量凋亡細胞,凋亡指數為35.81%±1.10%,遠端后處理組缺血區心肌凋亡指數為21.79%±1.07%,顯著低于缺血/再灌注組(P＜0.05,表4)。

Fig.1 Myocardial cell shape(HE ×200)

Fig.2 Tunel test results(TUNEL ×400)

2.6 Caspase-3的表達

與假手術組4.57%±1.72%比較,缺血/再灌注組caspase-3陽性細胞指數明顯增加,39.00%±2.43%(P＜0.05);而RPostC組的陽性細胞指數25.03%±1.16%與缺血/再灌注組比較顯著減小(P＜0.05,表 4)。

Tab.4 Tunel and caspase-3 positive cells index(%,±s,n=6)

Tab.4 Tunel and caspase-3 positive cells index(%,±s,n=6)

*P＜0.05 vs Sham;#P＜0.05 vs I/R

Group Tunel Caspase-3 Sham 3.22±0.70 4.57±1.72 I/R 35.81±1.10* 39.00±2.43*RpostC 21.79±1.07*# 25.03±1.16*#

2.7 Bcl-2及Bax的表達

與Sham組比較,I/R組及RPostC組Bax蛋白表達指數、Bcl-2蛋白表達指數均升高,RPsotC組的Bax/Bcl-2比值降低,而I/R組的Bax/Bcl-2比值升高。與I/R組相比較,RPostC組Bax蛋白表達指數及Bax/Bcl-2比值顯著降低,Bcl-2表達指數顯著升高,差異均有統計學意義(P＜0.05,表5)。

Tab.5 Bcl-2 and Bax protein expression ratio(±s,n=6)

Tab.5 Bcl-2 and Bax protein expression ratio(±s,n=6)

*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs I/R

Group Bcl-2 Bax Bax/Bcl-2 Sham 0.36±0.07 0.31±0.02 0.84±0.72 I/R 5.81±1.70* 16.85±2.43* 3.37±0.28*RpostC 14.79±1.07*# 4.03±1.16*# 0.27±0.46*#

3 討論

急性心肌梗死是嚴重危害人類健康的常見疾病。溶栓或直接經皮冠狀動脈介入治療(PCI)等再灌注治療可以有效恢復冠脈血流,減少心肌梗死面積,但在再灌注治療的同時也會帶來再灌注損傷,表現在促進缺血心肌的凋亡[3],加重心肌的損傷[4]等。因此,再灌注損傷明顯影響了血管開通的治療的效果。缺血預處理及后處理均是機體的有效保護機制,其心臟保護作用已經在犬、兔和鼠等動物模型上得到了證實[2,5,6]。缺血后處理的心肌保護作用不僅可以通過心臟本身的反復缺血/再灌注而獲得,還可以通過心臟外器官如腎動脈、肢體動脈及腸系膜動脈等來實現。通過其短暫的缺血/再灌注而產生類似的心臟保護效應,即遠端缺血后處理。2005年,Kerendi等[7]人證實在心肌缺血/再灌注末實施的短暫性腎臟缺血/再灌注能夠顯著的減少心肌梗死的面積。然而,作為一種外周器官,骨骼肌具有操作方便、耐受力強等特點,但骨骼肌遠端缺血后處理對心肌壞死和凋亡的影響目前的研究和報道較少。

關于遠端缺血后處理的作用機制,已有大量實驗進行研究。Kerendi等提出這種遠端器官提供的保護作用(腎對心臟),可能與腎缺血/再灌注引起腺苷(ADO)的釋放有關,隨后又激活了心臟腺苷受體。Liu等[8]在對兔腎臟的研究中發現,遠端腎臟的缺血后處理減少了心臟缺血/再灌注的心肌細胞的凋亡,同時上調Bcl-2的表達,下調Bax的表達,此作用可能與蛋白激酶C(PKC)的激活有關。

心肌的損傷包括心肌細胞的壞死和凋亡,其中壞死是主要的表現形式,但凋亡在細胞損傷過程中同樣起著極其重要的作用。細胞凋亡是一個由多種因素引起的復雜過程,受多種蛋白因子的調控,其中caspase-3(半胱天冬酶-3)和Bcl-2水平的高低是決定細胞凋亡的重要因素。在凋亡階段,caspase-3主要負責對關鍵性蛋白的酶切,caspase-3一旦被激活,細胞凋亡的發生就將不可逆轉。Sun等[9]在肝缺血/再灌注模型中發現在缺血后處理中Bcl-2蛋白明顯提高而且凋亡指數顯著下降,進而提出后處理可通過促進抑凋亡基因Bc1-2的表達、抑制凋亡執行者caspase-3酶的活性,從而抑制再灌注誘導的細胞凋亡。

本研究結果顯示,在冠狀動脈再灌注早期給予兔雙下肢髂外動脈短暫缺血/再灌注能夠明顯減輕兔心肌缺血/再灌注損傷,減少血清CK的釋放,同時也明顯地減小了心肌梗死的程度。此結果與Li等[10]在兔骨骼肌后處理模型中的研究結果相一致,其可能與減少氧自由基釋放,增強抗氧化功能有關。同時,骨骼肌缺血后處理不僅減少caspase-3的表達,還減少Bax/Bcl-2的表達比例,增加Bcl-2的表達,而Bcl-2是一個抑制細胞凋亡的重要因素,其能夠在多階段、多層次阻斷細胞凋亡的進程。可以抑制線粒體的破裂,阻止凋亡執行者caspase-3的激活物細胞色素C的釋放,還可直接與凋亡蛋白酶激活因子1結合,使caspase-3無法激活,從而起到抑制細胞凋亡的作用。

由此可以看出,骨骼肌遠端缺血后處理不僅減少了心肌壞死的程度,而且減少了缺血/再灌注心肌缺血區心肌細胞的凋亡。推測其原因,骨骼肌的缺血后處理抑制了兔心肌缺血/再灌注早期啟動的凋亡程序,抑制了其促凋亡基因caspase-3的表達,促進了抑凋亡基因Bcl-2的表達,減少了Bax/Bcl-2的蛋白表達比例,從而抑制了凋亡的進程。骨骼肌遠端缺血后處理對心肌細胞的壞死和凋亡都有著有效的控制作用,這為骨骼肌遠端后處理能夠應用于臨床提供了可靠的動物實驗數據。

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