缺血后處理降低高膽固醇血癥大鼠心肌對缺血/再灌注損傷的易感性及其機制*

趙煥新,李曉宇,武 燁,王曉木梁,趙榮瑞,劉慧榮

(1.山西中醫學院生理教研室,太原 030024;2.山西醫科大學,太原 030001;3.首都醫科大學生理學與病理學系,北京 100069)

缺血性心臟病嚴重危害著人類健康,目前臨床對于缺血性心臟病的治療主要采取解痙、溶栓等方法以盡早恢復缺血區的血液再灌,但是再灌注本身會引起細胞發生額外損傷即再灌注損傷。已有研究證實[1],缺血后處理(ischemic postconditioning,PostC)能夠明顯減輕缺血/再灌注導致的心肌損傷。但是在臨床上,冠脈梗塞所致的心肌缺血多發生于老年人,且常常伴有高膽固醇血癥(hypercholesteremia,HC),而高膽固醇血癥會明顯加重缺血/再灌注造成的心肌損傷。關于缺血后處理能否同樣減輕高膽固醇血癥基礎發生的心肌缺血/再灌注損傷及其可能的機制,目前研究尚不明確。因此,本研究通過建立食源性高膽固醇血癥但不發生動脈粥樣硬化的大鼠模型,旨在探討缺血后處理對高膽固醇血癥基礎上發生的心肌缺血/再灌注損傷的影響,以及低氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑

Even's blue和 TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑):Sigma;肌酸激酶(creatine kinase,CK)檢測試劑盒:南京建成生物工程研究所;血清甘油三脂(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL)檢測試劑盒:中生北控生物科技股份有限公司;caspase-3活性檢測試劑盒:BIOMOL,USA;HIF-1α兔多克隆抗體、β-Actin兔多克隆抗體:Santa Cruz

1.2 模型建立

1.2.1 高膽固醇血癥大鼠模型建立 健康雄性Wistar大鼠60只,體重(120±10)g,分為兩組(n=30):普通飲食組(普通飼料喂養8周),高脂飲食組(高脂飼料[2]喂養8周)。定期稱量大鼠體重,于8周時鼠尾采血測定血脂水平。成模標準:以TC、TG、LDL水平與正常飲食組相比顯著升高(P＜0.05)為成模標準。

1.2.2 大鼠心肌缺血/再灌注和缺血后處理模型建立 喂養 8周后的大鼠,參照本實驗室常規方法[2,3],結扎大鼠冠狀動脈左前降支造成左心室缺血,以心電圖出現ST段和(或)T波抬高或降低等心肌缺血波形為結扎成功標準。結扎30 min(即缺血30 min)后,松開結扎線恢復冠脈血液灌注并持續(即再灌注)3 h。結扎冠狀動脈左前降支缺血30 min后,松開結扎線10 s,再次結扎進行缺血10 s,依此重復三次,然后持續再灌3 h(即缺血后處理)。

1.3 實驗分組

實驗共分6組(n=10):(1)正常飲食-偽手術組(N-sham,):僅在冠狀動脈左前降支(LAD)下穿線,不結扎,持續 210 min;(2)正常飲食-缺血/再灌注組(N-I/R):缺血30 min,再灌注3 h;(3)正常飲食-缺血后處理組(N-PostC):結扎LAD 30 min,隨即進行10 s再灌注+10 s缺血,重復3次,隨后再進行3 h再灌注;(4)高膽固醇血癥-偽手術組(HC-sham):手術操作同(1);(5)高膽固醇血癥-缺血/再灌注組(HC-I/R):手術操作同(2);(6)高膽固醇血癥-缺血后處理組(HC-PostC):手術操作同(3)。

1.4 指標測定

1.4.1 心梗面積測定 參考本實驗室常規方法[2,3],于再灌注結束后再次結扎LAD,經股靜脈注入2%Even's blue后快速取出心臟,將左心室垂直于心腔縱軸方向自心底向心尖平均切成六片環形的薄片,在37℃于 1%TTC中避光孵育15min,用10%福爾馬林固定。正常的心肌組織被染成藍色,缺血區的心肌組織被染為紅色,梗死的心肌組織為白色。用掃描儀對心臟切面進行掃描,利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分別測定藍色、紅色和白色區域面積。缺血區面積(AAR/LV,%)=(缺血區總面積/左心室面積)×100%;心梗面積(An/AAR,%)=(梗死區面積/缺血區總面積)×100%

1.4.2 血清CK活性的測定 實驗結束后經腹主動脈取血,室溫靜置30 min,1 000 r/min離心15 min,取血清,采用南京建成生物工程研究所的CK檢測試劑盒進行測定。

1.4.3 心肌組織caspase-3相對活性的測定 心肌組織充分裂解后于4℃、10 000×g離心10 min,取50 μ l上清與底物于37℃孵育1.5 h,酶標儀檢測其光密度(OD)值。用蛋白含量標準化校正OD值,以sham組的活性為1,計算其余各組的相對活性(比活性)。

1.4.4 實時定量PCR法測定心肌組織HIF-1αmRNA的表達 再灌注結束后取缺血區心肌組織約50 mg,參照文獻方法提取總 RNA、每個樣品取3 μ g總RNA進行反轉錄后,于Mx3005實時定量PCRSystem上進行擴增 ,選用 β-actin 作為對照 。 采用 2-ΔΔCt法對HIF-1α mRNA進行相對定量計算。

1.4.5 Western-blot方法檢測心肌組織HIF-1α的蛋白水平 再灌注結束后取缺血區心肌組織約50mg,參照文獻方法,反應結束后經DAB顯色,掃描目的條帶,采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統進行積分光密度(IOD)測量分析。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 高脂飲食喂養8周后大鼠血脂水平明顯增加

如表1所示,給予高脂飼料前,60只大鼠的血脂水平無明顯差異,其中30只經高脂飲食喂養后,血脂水平較8周前顯著提高,其血清中TC、TG及LDL水平顯著高于同期普通飲食喂養的大鼠血脂水平(P＜0.01),表明高脂模型建立成功。

2.2 高膽固醇血癥增加了心肌對缺血/再灌注損傷的敏感性

心肌缺血/再灌注后,正常飲食大鼠心肌梗死面積(梗死區面積/缺血區總面積,An/AAR,圖1A)為33.4%±1.4%,而高膽固醇血癥大鼠心肌梗死面積達39.5%±1.2%,高膽固醇血癥使缺血/再灌注造成的心梗面積略有所增加。此外,與正常飲食大鼠相比,高膽固醇血癥使缺血/再灌注大鼠血清CK活性進一步增加(高膽固醇血癥組0.56±0.06 U/mlvs正常飲食組0.47±0.04 U/ml,P＜0.01,圖1B)。與上述結果一致,缺血/再灌注導致的高膽固醇血癥大鼠心肌caspase-3活性(4.63±0.42)比正常飲食大鼠caspase-3活性(2.31±0.27,P＜0.01,圖1C)增加更加顯著。

以上結果提示,高膽固醇血癥增加了心肌對缺血/再灌注損傷的敏感性。

Tab.1 Plasma lipid level of baseline and after fed for 8 weeks(mmol/L,±s,n=30)

Tab.1 Plasma lipid level of baseline and after fed for 8 weeks(mmol/L,±s,n=30)

TC:Total cholesterol;TG:Triglyceride;LDL:Low density lipoprotein**P＜0.01 vs normal diet group

Group Baseline After fed for 8weeks TC TG LDL TC TG LDL Normal diet group 2.82±0.50 0.64±0.15 0.88±0.19 2.70±0.96 1.01±0.08 1.00±0.19 High fat diet group 2.92±0.47 0.64±0.21 0.90±0.16 4.10±0.61** 1.36±0.39** 1.73±0.57**

2.3 缺血后處理顯著減輕了高膽固醇血癥大鼠缺血/再灌注所致的心肌損傷

如圖1A所示,在正常飲食組和高膽固醇血癥組,缺血后處理均可縮小缺血/再灌注導致的心肌梗死面積(正常飲食組:24.8%±1.8%vs33.4%±1.4%,P＜0.05;高膽固醇血癥組:29.7%±3.5%vs39.5%±1.2%,P＜0.01),降低血清CK活性(圖1B)及心肌組織 caspase-3活性(圖 1C),且兩組減小程度均無明顯差異。以上結果提示,不論是正常組或高膽固醇血癥組,缺血后處理都可以有效減輕缺血/再灌注造成的心肌損傷。

2.4 缺血后處理提高了高膽固醇血癥大鼠缺血/再灌注心肌組織HIF-1α的蛋白水平

Western-blot方法檢測缺血/再灌注心肌組織中HIF-1α的蛋白表達水平的結果顯示,缺血/再灌注使高膽固醇血癥大鼠心肌組織中HIF-1α的蛋白含量明顯增加,達到偽手術組的1.81倍;而給予缺血后處理后,HIF-1α的蛋白水平進一步提高,為偽手術組的3.02倍(P＜0.01,圖2)。結果提示,心臟經過長時間缺血之后,缺血后處理仍然可以觸發HIF-1α蛋白的表達。用實時定量RT-PCR方法檢測各組大鼠心肌組織HIF-1α mRNA的表達,結果表明,心肌組織中HIF-1α mRNA水平在各組大鼠間無明顯差異。

2.5 心肌組織HIF-1α蛋白水平與心梗面積之間的相關性分析

我們對高膽固醇血癥大鼠心肌組織HIF-1α的蛋白表達水平與作為反映心肌缺血/再灌注損傷的金指標---心梗面積之間作了相關性分析,結果顯示,HIF-1α的蛋白水平與心梗面積呈顯著負相關(r=-0.802,P＜0.01,圖3)。

3 討論

高膽固醇血癥是缺血性心臟病發生發展過程中最主要的一個危險因素。流行病學研究顯示,血清總膽固醇濃度升高與心肌梗死的發病率和死亡率之間存在著顯著的相關性。Osipov等[4]對高膽固醇飲食喂養16-20周的豬進行缺血/再灌注的研究發現,高膽固醇血癥顯著加重了缺血/再灌注所致的心肌梗死和心肌細胞凋亡。本研究在食源性高膽固醇血癥大鼠模型中也觀察到,高膽固醇血癥使缺血/再灌注造成的心肌梗死面積進一步擴大,血清CK活性及心肌細胞凋亡明顯增加,這些結果均說明高膽固醇血癥增加了心肌組織對缺血/再灌注損傷的易感性。

2003年Zhao等[1]在對犬進行心肌缺血/再灌注的研究中首次提出了“缺血后處理”(ischemic postconditioning,PostC)的概念,發現缺血后處理可以明顯減輕再灌注造成的心肌損傷。目前,缺血后處理的效應已經在動物模型[5]和臨床觀察[6]中得到證實。但是值得注意的是,目前對缺血后處理減輕再灌注損傷的實驗研究大都是采用健康動物作為模型,而缺血后處理對于伴發高膽固醇血癥的心肌缺血/再灌注損傷是否同樣具有保護效應,還存在爭議。Martin等[7]在對高脂飲食喂養的兔進行心臟離體灌流時觀察到,缺血后處理通過激活A1受體和KATP通道可以減小心肌梗死面積;而Iliodromitis[8]等則在高膽固醇血癥伴動脈粥樣硬化的兔模型上發現缺血后處理并不能改善缺血/再灌注造成的心肌梗死。類似的研究大多是利用兔建立高膽固醇血癥模型后對心臟進行離體灌流,而且在研究時該模型高膽固醇血癥基本上已發展為不同程度的動脈粥樣硬化。因此這些研究結果提示,動脈粥樣硬化的不同進程可能影響了對缺血后處理效應的研究。為此,我們在研究中利用大鼠建立了食源性高膽固醇血癥但不發生動脈粥樣硬化的模型[9],結果發現缺血后處理同樣可以縮小高膽固醇血癥大鼠缺血/再灌注所致的心肌梗死面積、減少心肌細胞凋亡。

Fig.1 Effects of ischemia/reperfusion and ischemic postconditioning onmyocardial injury in both normal and hypercholesteremic rats

缺血后處理的心肌保護機制可能涉及多種因素、多條途徑共同參與,但是在眾多機制中究竟哪一種因素起始發、主導作用還不清楚。有研究表明[10],HIF-1α作為氧平衡調節中起關鍵作用的轉錄因子,其表達增加可能是心肌缺血/再灌注過程中最早期的分子水平上的適應性反應,可以增強心肌對抗缺血/再灌注損傷的能力。在本研究中我們檢測了高膽固醇血癥大鼠缺血后處理心肌組織中HIF-1α的蛋白水平,結果發現缺血后處理進一步上調了HIF-1α的蛋白表達水平,而且隨著HIF-1α蛋白水平增加,缺血/再灌注造成的心肌梗死面積明顯減小,二者之間呈現顯著負相關。這一結果提示,HIF-1α可能是缺血后處理減輕高膽固醇血癥大鼠心肌缺血/再灌注損傷的機制之一。

Fig.2 Effect of ischemic postconditioning on the expression of HIF-1αprotein level in hypercholesteremic rats

Fig.3 Linear analysis between infarct size(An/AAR)and HIF-1αprotein expression

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