縫隙連接在同型半胱氨酸介導的自發性高血壓大鼠血管平滑肌細胞增殖中的作用*

鐘 華,胡清華,王恩幫,司軍強,孫志萍,李增春,何 芳△

(1.新疆地方病與民族高發病教育部重點實驗室,2.石河子大學醫學院病理生理教研室,3.生理教研室,4.醫學機能實驗中心,石河子832002;5.華中科技大學同濟醫學院病理生理學系,衛生部呼吸系統疾病重點實驗室,湖北 武漢 430030)

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMCs)增殖、遷移和表型的變化導致的血管壁增厚和血管緊張度的增加是高血壓發病的關鍵。由縫隙連接蛋白(connexin,Cx)構成的直接通訊-縫隙連接(gap junction,GJ)在調節血管舒縮、血管平滑肌細胞增殖、平滑肌的表型轉變中起著重要作用,并與高血壓發生密切相關[1]。我們及其他學者前期的研究發現同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)血漿水平升高使人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)活性減弱、一氧化氮(nitric oxide,NO)含量降低,并削弱了NO的血管舒張作用,增加氧化應激,刺激血管平滑肌細胞增生,改變血管壁彈性,增加血管阻力,因此促成血壓升高[2,3],GJ是否參與了Hcy介導的高血壓大鼠VSMCs增殖效應尚不清楚。因此本文以體外培養自發性高血壓大鼠VSMCs為研究對象,初步探討了縫隙連接在Hcy介導的SHR血管平滑肌細胞增殖中的作用及分子機制,為高血壓的防治提供新靶標。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 3～10周齡,150～200 g自發性高血壓大鼠(購自北京維通利華實驗動物有限責任公司,許可證編號SCXK京2007-0001),雌雄不限。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養基(Gibco),胎牛血清/小牛血清(Hyclone),胰蛋白酶(Sigma),Hcy(Sigma),18α-GA(Sigma),抗 а-Actin 單克隆抗體(Dako),抗Cx40單克隆抗體(Invitrogen),抗Cx43單克隆抗體(Invitrogen),羅氏黃(Molecular probes),羅丹明-葡聚糖(Molecular probes),發光試劑盒(Pierce)

1.2 方法

1.2.1 VSMCs的培養和鑒定 取3～10周齡,150～200 g自發性高血壓大鼠,雌雄不限,斷頭處死。無菌條件下取胸主動脈,以貼塊法培養VSMC,細胞生長融合后,用0.25%的胰蛋白酶消化,以105～106cells/ml的密度傳代培養,對細胞進行形態學觀察并對細胞內平滑肌肌動蛋白α-Actin進行免疫細胞化學染色,95%以上的細胞呈陽性著色,證實細胞為VSMC。取3～5代細胞用于實驗。

1.2.2 實驗分組 將細胞以5×104cells/ml的密度培養24 h后吸去孔內液體,加入無血清培養基,24 h后再次吸去孔內液體,按以下分組加入試劑:(1)對照組:加含10%FBS的DMEM;(2)Hcy組:加含Hcy濃度為0.05 mmol/L的含10%FBS的DMEM;(3)縫隙連接阻斷劑組:加含18α-GA 濃度為50 μ mol/ml的含10%FBS的DMEM;(4)Hcy+縫隙連接阻斷劑組:加含Hcy和18α-GA的濃度分別為0.05 mmol/L和 50 μ mol/ml的含 10%FBS的 DMEM。

1.2.3 免疫熒光細胞化學檢測Cx40、Cx43在細胞內表達及共定位 按實驗分組制作細胞爬片,用PBS洗三遍,4%預冷的多聚甲醛固定20 min后用含0.2%Triton的PBS液洗三遍,0.2%Triton X-100室溫透膜30 min,含0.2%Triton的PBS洗三遍,血清封閉30 min,含0.2%Triton的PBS洗三遍,加入一抗Cx40(1∶100)、Cx43(1∶50)4℃濕盒內過夜,含0.2%Triton的PBS洗三遍后,加入FITC標記二抗(1∶50);羅丹明TRITC標記二抗(1∶50),室溫避光孵育2 h,含0.2%Triton的PBS沖洗3次,加核染料DAPI(1∶1 000)室溫避光孵育15 min,含0.2%Triton的PBS洗三遍,60%緩沖甘油封片,激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.4 MTT法檢測VSMCs的增殖活性 制備細胞懸液,用含10%FBS的DMEM液稀釋成5×104cells/ml,接種于 96孔板 ,每孔加入 200 μ l混勻后的細胞懸液,置于37℃,5%CO2恒溫培養箱中孵育24 h。棄去培養液,用PBS液沖洗1～2遍。每孔加入不含FBS的DMEM 液 ,各200 μ l,繼續培養24 h,使細胞同步于G0/G1期。棄去培養液,分別按實驗分組加入試劑,每組8個復孔,置于培養箱培養 24 h后,各組棄去培養液,每孔加入MTT 20 μ l,孵育 4 h,加入DMSO 150 μ l,于酶標儀上檢測各孔570 nm處吸光度(A值)。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞周期 在六孔板內各組試劑作用24 h后吸凈孔內培養基,PBS沖洗兩次,離心后,棄上清液加PBS液吹打均勻,離心,重復2次棄上清液加PBS液吹打均勻,然后加入70%酒精4℃過夜,至少18 h,離心后,加PBS重懸離心同上,重復2次后,加碘化丙錠(propidium iodide,PI)染液0.5 ml,置于4℃,30 min后上流式細胞儀,重復4次,進行細胞周期測定,通過特殊軟件計算S期的百分率,以S值反映細胞增殖能力。

1.2.6 Western blot法檢測SHR VSMCs內Cx40、Cx43蛋白表達 在六孔板內各組試劑作用24 h后吸凈孔內培養基,預冷PBS沖洗3次,加入細胞裂解液200 μ l,吹打 ,轉入 1.5 ml EP 管中,保持 冰上 30 min后4℃離心,取上清用5×加樣緩沖液稀釋,煮沸6～8 min,BCA法測蛋白質濃度進行蛋白質定量,-20℃保存。所有實驗均獨立重復3次。以上蛋白樣品(30 μ g)經10%聚丙烯凝膠電泳分離后,恒壓25 V電轉移50 min到硝酸纖維素濾膜(NC)上,然后封閉緩沖液(5%脫脂牛奶或牛血清白蛋白)中封閉1 h。將膜放入用5%封閉液稀釋的第一抗體(Cx43稀釋比例為1∶1 000;Cx40稀釋比例為 1∶200)中,在室溫下孵育,持續搖動 2 h。1×TBST(10 mmol/L Tris-HCl,pH 7.4,150 mmol/L氯化鈉,0.05%Tween-20)洗膜,將膜用封閉緩沖液稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的第二抗體(1∶2 000稀釋),室溫作用2 h,1×TBST洗膜,新鮮配制的ECL顯色液1 ml(A、B液等體積混勻)和膜孵育1 min,封入保鮮膜中,壓片,顯影于感光膠片上。將經以上處理的NC膜用洗脫緩沖液(strip buffer)室溫孵育1 h后,洗膜3次,每次15 min。用β-actin內參抗體(1∶1 000)室溫孵育2h,以同樣方法顯影于感光膠片。用Bandleader 3.0軟件對條帶進行灰度掃描,按下述公式分別計算三次實驗中樣品蛋白的相對含量:蛋白相對含量(該蛋白條帶的灰度值-背景的灰度值)/(對照條帶的灰度值-背景的灰度值),以此比值計算均數與標準差。

1.2.7 染料示蹤分子傳遞法(劃痕標記染料傳輸法)檢測血管平滑肌細胞間縫隙連接功能 在六孔板內各組試劑作用24 h后吸凈孔內培養基,以37℃預溫的PBS沖洗細胞3次,加熒光染料0.05%羅氏黃(Lucifer yellow,LY)和 0.05%羅丹明-葡聚糖1∶1混合液,每孔1 ml,用銳利的外科手術刀在細胞表面上劃痕數條并計時,孵育3 min吸出熒光染料,PBS沖洗細胞3次,然后加入少量PBS以剛好覆蓋細胞為宜,熒光顯微鏡下觀察,羅氏黃熒光的顯示用FITC系統的濾光片,羅丹明-葡聚糖用羅丹明系統濾光片,LY熒光染料傳遞百分數=LY熒光陽性細胞數(劃痕細胞外)/劃痕標記的細胞(即RD+LY陽性細胞數),重復實驗3次,統計分析后,以此代表縫隙連接功能的強弱。其大小代表細胞間縫隙連接通訊功能強弱。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 免疫熒光技術檢測SHR VSMCs中Cx43與Cx40蛋白的表達及兩者的共定位

共聚焦熒光顯微鏡下觀察,綠色熒光為Cx43的陽性著色,主要定位于胞漿,紅色熒光為Cx40的陽性著色,主要定位于胞漿與胞膜,橙色熒光為兩者的合成熒光,主要定位于胞漿,藍色熒光顯示為細胞核的DNA染料(DAPI)陽性著色,可見SHR VSMCs中Cx43與Cx40蛋白表達呈陽性,兩者共定位于胞漿(圖1)。

Fig.1 Expression and co-localization of the Cx43 and Cx40 proteins in the SHR VSMCs by confocal microscopy(FITC,TRITC,DAPI,confocal microscopy×40)

2.2 VSMCs的增殖

2.2.1 各實驗組VSMCs的增殖活性 結果顯示:與control組相比,Hcy組的A值增高(P＜0.05),VSMCs增殖活性增加,縫隙連接阻斷劑(18α-GA)組的A值降低(P＜0.05),VSMCs增殖活性減少,Hcy+18α-GA組A值無明顯差異(P＞0.05);與Hcy組相比,Hcy+18α-GA組A值明顯降低(P＜0.05),VSMCs增殖活性減少(表1)。

Tab.1 A value of different groups in SHR VSMCs by MTT(±s,n=10)

Tab.1 A value of different groups in SHR VSMCs by MTT(±s,n=10)

Hcy:Homocysteine;GA:Glycyrrhetinic acid;SHR:Spontaneously hypertention rat;VSMC:Vascular smooth muscle cell*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs Hcy group

Group A570 Control 0.34±0.04 Hcy 0.44±0.04*18α-GA 0.27±0.02*#Hcy+18α-GA 0.32±0.05#

2.2.2 流式細胞儀檢測細胞周期 與control組相比,Hcy組S值增高(P＜0.05),VSMCs增殖能力增加,18α-GA組S值降低(P＜0.05),VSMCs增殖能力減弱,Hcy+18α-GA組 S值無顯著性差異(P＞0.05);與Hcy組相比,Hcy+18α-GA 組S值明顯降低(P＜0.05),VSMCs增殖能力減弱(圖2,表2)。

Fig.2 PI atlas of cell cycle in SHR VSMCs from different groups A:Control group;B:Hcy group;C:18α-GA group;D:Hcy+18α-GA group;PI:Propidium iodide

Tab.2 Percentage of speriod in cell cycle in SHR VSMCs of different groups(±s,n=4)

Tab.2 Percentage of speriod in cell cycle in SHR VSMCs of different groups(±s,n=4)

Hcy:Homocysteine;GA:Glycyrrhetinic acid;SHR:Spon taneously hypertensive rat;VSMC:Vascular smooth muscle cell*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs Hcy

Group Percentage of speriod in cell cycle Control 23.36±1.89 Hcy 29.40±2.07*18α-GA 14.33 ±1.13*#Hcy+18α-GA 21.18 ±1.37#

2.2.3 Western blot法檢測SHR VSMCs內Cx40、Cx43蛋白表達 與control組相比,Hcy組Cx43、Cx40蛋白表達均增強(P＜0.05),18α-GA 組Cx43、Cx40表達均減弱(P＜0.05),Hcy+18α-GA 組Cx43、Cx40表達均無顯著性差異(P＞0.05);與Hcy組相比,Hcy+18α-GA 組 Cx43、Cx43 表達減弱(P＜0.05,圖3,表 3)。

2.2.4 染料示蹤分子傳遞法檢測血管平滑肌細胞間縫隙連接功能 與control組相比較,Hcy組熒光染料傳遞分數增加,縫隙連接功能明顯增強(P＜0.05),18α-GA組熒光染料傳遞分數降低,縫隙連接功能明顯減弱(P＜0.05),Hcy+18α-GA組熒光染料傳遞分數無明顯差異,縫隙連接功能無顯著差異(P＞0.05);與Hcy組相比,Hcy+18α-GA 組熒光染料傳遞分數降低,縫隙連接功能顯著降低(P＜0.05,圖 4,表 4)。

Fig.3 Expression of the Cx43 and Cx40 proteins in SHR VSMCs of different groups

Tab.3 Expression of the Cx43 and Cx40 proteins in VSMC of different groups(±s,n=3)

Tab.3 Expression of the Cx43 and Cx40 proteins in VSMC of different groups(±s,n=3)

Hcy:Homocysteine;GA:Glycyrrhetinic acid;VSMC:Vascular smooth muscle cell;Cx:Connexin*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs Hcy

Group Cx43/β-actin Cx40/β-actin Control 0.31±0.02 0.36±0.01 Hcy 0.62±0.14* 0.42±0.02*18α-GA 0.28±0.01*# 0.31±0.01*#Hcy+18α-GA0.32±0.01# 0.35±0.02#

Fig.4 Atlas of gap junctionfunction detected by scrape dye transfer method of scrape dye transfer method in VSMC of different groups(scale bar=100μ m)

3 討論

近年來的研究表明高同型半胱氨酸血癥能夠導致血管內皮損害,促進低密度脂蛋白的氧化、血小板的聚集、血管平滑肌細胞增殖,對正常大鼠VSMCs的作用由于細胞密度,Hcy濃度的不同而不同。研究發現一定劑量的Hcy能誘導SHR VSMCs增殖[5,6],在我們前期的研究中顯示:隨著Hcy濃度的升高,SHR VSMCs增殖增加明顯,當Hcy濃度 ＞0.1 mmol/L時,細胞增殖增加開始降低。

Tab.4 Percentage of immune fluorescent dye transfered in SHR VSMCs of different groups(±s,n=3)

Tab.4 Percentage of immune fluorescent dye transfered in SHR VSMCs of different groups(±s,n=3)

Hcy:Homocysteine;GA:Glycyrrhetinic acid;SHR:Spontaneously hypertension rat;VSMC:Vascular smooth muscle cell*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs Hcy

Group Percentage of immune fluorescent dye transfered Control 0.61±0.10 Hcy 0.74±0.17*18α-GA 0.46 ±0.05*#Hcy+18α-GA 0.60 ±0.12#

縫隙連接是由連接相鄰兩個細胞之間的連接通道排列而成的一種特殊膜結構。它由細胞膜上的連接子相互銜接而成,每個連接子由六個縫隙連接蛋白(Cx)圍成,連接子即Cx的六聚體所形成的跨膜蛋白通道[7]。不同類型的連接蛋白可以形成不同類型的連接子,構成不同類型的連接通道,不同連接蛋白分子之間組合形成的縫隙連接通道的通透性和導電性有所不同[8],從而使得縫隙連接在結構組成和功能上表現出多樣性[9],并對血管平滑肌舒縮等生理過程起著重要的調控作用。而血管平滑肌細胞以Cx43,Cx40表達為主。

我們通過用Hcy和縫隙連接阻斷劑(18α-GA)處理SHR VSMCs,通過MTT法和流式細胞技術檢測SHR VSMCs A值和S值發現:Hcy進一步促進了細胞的增殖,當縫隙連接阻斷后,完全阻斷了Hcy對細胞的促增殖效應。本研究結果首次證實,縫隙連接可能參與了Hcy介導的SHRVSMCs的增殖作用。

為了進一步探討Hcy是否通過改變連接蛋白的表達,調節縫隙連接通道的功能,影響細胞間直接通訊,并導致血管平滑肌細胞增殖?在本研究中我們用激光共聚焦顯微鏡觀察Cx43、Cx40蛋白表達及定位,結果顯示兩者共定位于胞漿,并通過Western blot各組Cx43、Cx40的蛋白表達,結合劃痕標記染料傳輸法檢測了不同處理因素作用下各組縫隙連接功能的變化,結果發現:Hcy可使SHR VSMCs Cx43和Cx40蛋白表達上調,增強了縫隙連接通訊功能。縫隙連接阻斷劑抑制了Hcy引發的Cx43和Cx40蛋白表達上調,并降低了縫隙連接功能。

在以往的研究中已證實Hcy都能通過細胞間間接通訊的方式引起高血壓,動脈粥樣硬化等心血管疾病的發生和發展。本研究以SHR血管平滑肌細胞為模型,發現Hcy通過上調SHR血管平滑肌細胞縫隙連接蛋白Cx43和/或Cx40的表達,引起細胞間直接通訊-縫隙連接通訊功能的增強,促進了SHR血管平滑肌細胞的增殖作用。進一步闡明了Hcy在高血壓等血管平滑肌細胞增殖相關疾病中的作用機制,并提供了新的理論基礎。

此外,縫隙連接功能的調節受多種因素的影響,如縫隙連接蛋白的表達,縫隙連接蛋白的磷酸化等,在本研究中我們僅從縫隙連接蛋白的表達做了初步研究,那么在不同處理因素作用下,縫隙連接蛋白的磷酸化有何變化?另外在本研究發現縫隙連接蛋白Cx43、Cx40參與了Hcy介導SHR血管平滑肌細胞增殖作用,在今后的研究中,我們將通過干擾Cx43、Cx40基因,進一步探討縫隙連接在Hcy介導SHR血管平滑肌細胞增殖作用及機制,為心腦血管疾病防治提供新靶標。

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