JNK在血糖波動的糖尿病大鼠腎小管上皮細胞凋亡中的作用*

郝卯林,戴雍月,倪世容,汪大望,李素娟,金可可△

(1.溫州醫學院病理生理教研室,2.附屬第一醫院內分泌科,浙江溫州325035;3.中國人民解放軍第八二醫院內分泌科,江蘇 淮安 223001)

近年資料表明,糖尿病慢性并發癥的發生和發展不僅與整體血糖控制水平密切相關,也與血糖波動性有關。血糖波動性越大,糖尿病慢性并發癥的發生率越高,預后越差[1]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者常見而嚴重的慢性并發癥,高血糖導致的腎臟細胞凋亡參與糖尿病腎病的發生、進展[2]。我們前期研究發現,糖尿病大鼠血糖明顯波動可加速腎小管上皮細胞凋亡[3]。業已證實,血糖波動更容易引發氧化應激[4];JNK為絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族中的重要成員,JNK信號通路是導致細胞凋亡的重要信號通路。研究表明,高水平的活性氧能直接激活JNK,也能通過抑制磷酸酶、活化MAP3Ks等間接激活JNK[5]。因此,本研究旨在觀察JNK信號轉導通路在波動性高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡中的作用,以探討波動性高糖比穩定性高糖引起更嚴重的腎小管上皮細胞凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)及枸櫞酸鈉分析純購于美國sigma公司;普通速效胰島素(400 U/10 ml)購于江蘇萬邦生化有限公司;強生(Johnson)穩步倍加血糖儀及試紙購于美國強生;MDA和SOD試劑盒購自南京建成生物工程研究所;TUNEL試劑盒購自Hoffmann-La Roche有限責任公司;非生物素標記的即用型免疫組化二抗試劑盒購自武漢博士德生物科技有限公司;兔抗大鼠JNK、p-JNK單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司;兔抗大鼠Nox4購自北京博奧森生物科技有限公司;PVDF膜購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗動物及模型制備

180～220 g雄性SD大鼠由本校實驗動物中心提供,隨機取10只作為正常對照(A),其余采用STZ按65 mg/kg腹腔注射誘發糖尿病,注射STZ 72 h后,尾部取血,測空腹血糖和刺激大鼠膀胱測尿糖,血糖＞16.7 mmol/L,尿糖3個+以上為造模成功,隨機取DN大鼠分為穩定高血糖組(B)和血糖波動組(C),C組每天定時腹腔注射速效胰島素,并錯時給予葡萄糖,造成1 d中血糖濃度大幅度波動模型(圖 1)。12周 C組每天血糖波動模式相似,且HbAlc在C組10.50%±0.69%與B組10.13%±0.96%比較無顯著性差異,提示波動性高血糖造模成功。12周后取腎臟組織用于指標測定。

Fig.1 Blood glucose variation curve of 3 groups

1.3 氧化應激指標測定

取腎組織勻漿,化學比色法測定SOD活性及MDA含量,操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4 TUNEL法檢測腎臟細胞凋亡

檢測方法嚴格按說明書操作。細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞,即凋亡細胞。計算5個高倍視野(×400)下的凋亡細胞數,以凋亡細胞/100個細胞表示凋亡指數(apoptosis index,AI)。

1.5 免疫組化檢測腎臟Nox4和JNK蛋白表達

采用SABC法,DAB顯色。檢測方法嚴格按說明書操作。光鏡下觀察,陽性反應為細胞漿呈棕黃色染色,不染色者為陰性。

1.6 Western blot檢測腎臟JNK蛋白表達

細胞經相應處理后加裂解液,超聲裂解,吸取上清液,用BCA法測定蛋白質濃度。取10 μ g蛋白上樣于12%聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉印至PVDF膜上,封閉1.5 h,加入1∶1 000稀釋的P-JNK、JNK 抗體和GAPDH抗體(內參),4℃過夜。Ⅰ抗反應結束后,加1∶3 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的特異性Ⅱ抗室溫孵育2 h,ECL試劑顯色并曝光成像,掃描并分析吸光度。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 波動性高血糖對糖尿病大鼠的腎臟氧化應激的影響

2.1.1 三組大鼠腎組織勻漿SOD活性和MDA含量的比較 與A組比較,B組和C組SOD活性明顯降低,且C組低于B組(P＜0.01);B組和C組MDA含量明顯升高,且C組高于B組(P＜0.01,表1)。

Tab.1 Comparison of the SOD activity andMDA content in renal tissue homogenate among different groups(±s,n=10)

Tab.1 Comparison of the SOD activity andMDA content in renal tissue homogenate among different groups(±s,n=10)

SOD:Soperoxideclismutase;MDA:Malonaldehyde*P＜0.05,**P＜0.01 vs normal control group;##P＜0.01 vs stable high blood glucose group

Group SOD(NU/ml) MDA(nmol/ml)Normal control 28.11±4.16 1.87±0.45 Stable high blood glucose 15.51±2.43** 3.72±0.74*Fluctuant high blood glucose7.77±1.61**##5.59±1.08**##

2.1.2 三組大鼠腎組織Nox4蛋白表達的比較 與A組和B組比較,C組腎小管上皮細胞Nox4蛋白表達明顯增強(圖2見彩圖頁Ⅳ)。

2.2 波動性高血糖對糖尿病大鼠的腎臟細胞凋亡的影響

A組腎小管上皮細胞幾乎未見凋亡細胞,B組(8.36%±2.66%)和C組(12.98%±2.81%)的腎小管上皮細胞凋亡數明顯增多,且C組較B組增多更加明顯(P＜0.01,圖3、4,圖3見彩圖頁Ⅳ)。

Fig.4 Apoptotic cell was detected by TUNEL in kidney of rats

2.3 波動性高血糖對糖尿病大鼠腎臟JNK蛋白表達的影響

免疫組化結果顯示,A組幾乎未見p-JNK蛋白表達,B組和C組腎小管上皮細胞p-JNK蛋白表達均明顯增強,且C組較B組表達更強(圖5見彩圖頁Ⅳ)。Western blot檢測結果表明,B組和C組的JNK蛋白和p-JNK蛋白表達量均較A組明顯增高,且C組高于B組(圖6)。

Fig.6 p-JNK protein level was detected by Western blot in kidney of rats

3 討論

糖尿病患者的高血糖主要有兩種形式,包括慢性波動性高血糖與慢性持續性高血糖。隨著糖尿病患者多項大型臨床試驗的開展以及對其病理生理機制的深入研究,目前多數研究認為,糖尿病慢性并發癥的發生與發展不僅與血糖整體水平升高有關,也與血糖的波動性密切相關。研究發現,相同的HbA1c值可以存在不同的血糖狀況,具有相近HbA1c值的患者中,血糖波動較大者發生慢性并發癥的風險更大[6]。本實驗中,我們通過對糖尿病大鼠12周模型的研究,發現糖尿病血糖波動組腎臟細胞凋亡指數是持續高血糖組的1.55倍,凋亡尤其發生在腎小管上皮細胞和間質細胞,因此進一步證實在糖化血紅蛋白水平相似的糖尿病動物中,血糖的波動幅度增大可加重腎小管上皮細胞的凋亡程度,研究已表明,腎組織細胞凋亡是DN的發生發展中一個重要的早期事件。

慢性持續性高血糖癥會導致過高的糖化反應和氧化應激的形成,而最近發現糖尿病發生的急性血糖波動是觸發氧化應激反應的一個額外因素[7]。業已證實,氧化應激是造成細胞凋亡的重要環節。本研究表明,糖尿病穩定高血糖組和波動性高血糖組的腎臟氧自由基清除劑SOD活性降低,脂質過氧化產物MDA含量增加,且波動性高血糖組的上述改變更加明顯,說明糖尿病時波動性高糖引發的腎臟氧化應激反應較穩定性高血糖增強。Yaqoob等[8]的早期研究提示,糖尿病發生的氧化應激對腎小管的損傷可能先于腎小球損害。我們進一步研究也發現,波動性高血糖大鼠的腎小管Nox4表達較穩定高血糖組更加明顯,細胞凋亡數也相應增加。Nox4是NADPH氧化酶的一種重要亞型,主要在成年腎組織表達,糖尿病時活性氧族(ROS)增高的來源有很多,其中NADPH氧化酶被認為是ROS產生的最重要機制,能夠將分子氧通過單電子還原產生過氧化自由基,并以此為基礎形成一系列ROS產物。高血糖可激活細胞內PKC信息轉導途徑從而活化NOX,而NOX抑制劑可有效抑制糖尿病大鼠腎組織中ROS的產生,減少蛋白尿和改善腎組織病理改變,延緩DN的發生發展[9]。以上結果提示,與穩定性高血糖比較,波動性高血糖狀態下的腎小管上皮凋亡增加與氧化應激水平增高有密切關系。

體內外實驗均證實,氧化應激能導致JNK激活,JNK又是細胞凋亡發生過程中的重要調控者。一般認為,JNK被磷酸化激活后,能通過轉錄依賴或轉錄非依賴機制調控下游靶基因的表達或靶蛋白的活性而介導細胞凋亡。研究發現,JNK被活化后可從胞質中轉位入核,通過磷酸化激活c-Jun、c-Fos等轉錄因子而調節凋亡相關靶基因的轉錄表達。活化的JNK也可留在胞質內,催化Bcl-2家族抗凋亡蛋白磷酸化而失去活性,促進細胞凋亡的發生[10]。本研究發現糖尿病持續高血糖組和波動高血糖組腎小管上皮細胞胞質JNK蛋白的磷酸化水平均明顯高于正常對照組,且波動高血糖組較持續高血糖組變化更為明顯,這與其氧化應激水平和凋亡程度增加的趨勢一致,提示血糖波動可能作為一種刺激信號,會引發較單純高血糖更加嚴重的氧化應激反應,通過激活JNK,進而促進細胞凋亡。

[1]王先令,陸菊明.血糖波動對糖尿病預后及其慢性并發癥發生發展的影響[J].國外醫學內分泌學分冊,2005,25(3):169-173.

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[3]金可可,林艷紅,王萬鐵,等.血糖波動對糖尿病大鼠腎小球內皮細胞和腎小管上皮細胞凋亡的影響[J].中國病理生理雜志,2007,23(3):570-573.

[4]Piconi L,CorgnaliM,Da Ros R,et al.The protective effect of rosuvastatin in human umbilical endothelial cells exposed to constant or intermittent high glucose[J].J Diabetes Complications,2008,22(1):38-45.

[5]Nakano H,Nakajima A,Sakon-Komazawa S,et al.Reactive oxygen species mediate crosstalk between NF-κ B and JNK[J].Cell Death Differ,2006,13(5):730-737.

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