Tau/APP/PS1三轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立及生物學(xué)特征*

王利利,納 鑫,朱小南,陳汝筑,汪 海,汪雪蘭△

(1.中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室,廣州 510080;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所,天津 300050)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,其典型的病理改變?yōu)樯窠?jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle,NFT)和老年斑(senile plaque,SP),分別由Tau蛋白異常磷酸化和淀粉樣蛋白(β-amyloid protein,Aβ)沉積引起。Tau和Aβ在AD發(fā)病機(jī)制中的作用和相互關(guān)系,以及產(chǎn)生的前后順序等尚未有定論[1]。

AD動(dòng)物模型是研究AD發(fā)病機(jī)制和研發(fā)治療藥物的必要工具。與AD相關(guān)的Tau、淀粉樣前體蛋白(amyloid precusor protein,APP)、早老素(presenilins,PS)等基因的單轉(zhuǎn)基因模型通常只能模擬AD其中一種病理變化。鑒于AD發(fā)病為多因素共同致病,所以利用不同的轉(zhuǎn)基因鼠雜交或多個(gè)基因同時(shí)轉(zhuǎn)入等方法,得到的多重(雙轉(zhuǎn)或三轉(zhuǎn))轉(zhuǎn)基因模型能更好的模擬臨床AD的發(fā)病過(guò)程和病理特征[2]。

本課題是將自行建立的Tau轉(zhuǎn)基因小鼠[3]與美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室引種的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠[4]雜交,篩選獲得Tau/APP/PS1三轉(zhuǎn)基因小鼠,旨在建立具有Tau和Aβ兩種病理改變和學(xué)習(xí)記憶障礙的動(dòng)物模型,為深入探究Tau與Aβ的關(guān)系、闡明AD的發(fā)病機(jī)制以及研發(fā)靶點(diǎn)治療藥物提供實(shí)驗(yàn)工具。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

Tau轉(zhuǎn)基因小鼠由本實(shí)驗(yàn)室自行建立的,APP/PS1二轉(zhuǎn)基因小鼠購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所,是從 美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室引種,品系名稱(chēng) B6C3-Tg[APPswe,PSEN1dE9]m 85Dbo/J。

1.2 藥品與試劑

抗人Tau蛋白的單克隆抗體(Tau-13)購(gòu)自Santa Cruz公司;抗人Aβ蛋白的單克隆抗體購(gòu)自CST公司;PVDF膜、二抗及ECL發(fā)光試劑盒均購(gòu)自Amersham公司;ABC染色劑和DAB顯色劑購(gòu)自Vector公司。

1.3 基因型鑒定

1.3.1 基因組DNA的提取 取鼠尾0.5～1 cm放入0.5 ml裂解緩沖液中(1%SDS、75 mmol/L NaCl,10 mmol/L Tris-Cl、25 mmol/L EDTA),加 20 g/L 蛋白酶K 2.5 μ l,置55℃振動(dòng)恒溫?fù)u床200 r/min消化過(guò)夜。酚/氯仿法提取和純化基因組DNA。

1.3.2 PCR Tau引物序列為5'-GGAGTTCGAAGTGATGGAAG-3'和5'-GGTTTTTGCTGGAATCCTGG-3',APP和PS1引物是根據(jù)Jackson實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)站公布的序列。PCR反應(yīng)為 94℃5 min;94℃45 s、56℃45 s和72℃45 s,共35個(gè)循環(huán),72℃10min,2%瓊脂糖凝膠電泳后,用GENE GENIUS凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.4 Morris水迷宮觀測(cè)學(xué)習(xí)記憶的改變

1.4.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)5 d,每天訓(xùn)練4次,每次間隔15 min。訓(xùn)練時(shí)隨機(jī)選擇一個(gè)象限為入水點(diǎn),采用遠(yuǎn)離目標(biāo)的象限入水成績(jī)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)[4],實(shí)驗(yàn)時(shí)間90 s,將小鼠找到水下平臺(tái)的時(shí)間計(jì)為逃逸潛伏期。

1.4.2 空間搜索試驗(yàn) 在最后一次訓(xùn)練后撤除水下平臺(tái),然后在平臺(tái)所在象限的對(duì)面象限的中點(diǎn)為入水點(diǎn)將小鼠面向池壁放入水中,測(cè)定它在90 s內(nèi)跨過(guò)水下平臺(tái)位置的次數(shù)。記錄上述參數(shù)和游泳路線軌跡。

1.5 RT-PCR檢測(cè)Tau、APP、PS1基因的轉(zhuǎn)錄

1.5.1 總RNA的提取、鑒定和含量測(cè)定 取大腦提取RNA,瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性,紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA含量。

1.5.2 RT-PCR 反應(yīng)體系包括 RNA 1 μ g,5×RT buffer 4.0 μ l,Olig(dT)20(20 μ mol/L)1.0 μ l,dNTP(10 mmol/L)2.0 μ l,RTase 1.0 μ l,DEPC water 至總體積為20 μ l。42℃孵育 60 min,95 ℃5 min,冰浴 5 min,PCR方法同前。

1.6 Western blot測(cè)定Tau和APP蛋白的表達(dá)量

1.6.1 蛋白的提取 取小鼠大腦,分離皮層和海馬區(qū)50～100 mg于離心管中,加裂解緩沖液(50 mmol/L Tris-HCL 10 ml,10%SDS 100 μ l,NP-40 100 μ l,2%NaN3 100 μ l,100 mmol/L PMSF 100 μ l,200 mmol/L NaVO450 μ l,EGTA 38.036 mg,蛋白酶抑制劑半片),12 000 r/min超聲破碎30 min,取上清,100℃煮沸5 min備用。

1.6.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳 配制8%的分離膠和4%的積層膠,取樣本35 μ g上樣于加樣孔中,200 V恒壓下電泳45 min。100 V轉(zhuǎn)膜60 min,孵育目的抗體,曝光,拍照,計(jì)算機(jī)圖像分析。

1.7 Bielschowsky染色法觀察神經(jīng)纖維纏結(jié)

將腦組織切片浸在4%硝酸銀中30 min;10%甲醛數(shù)秒,滴加氨銀乙醇溶液20～40 s,10%甲醛1～2 min,5%硫代硫酸鈉固定;梯度酒精脫水,中性樹(shù)膠封片。

1.8 ABC免疫組化法觀察老年斑

按試劑盒步驟操作。

2 結(jié)果

2.1 基因型鑒定

內(nèi)參β-actin1是 700 bp,β-actin2是 300 bp;Tau 是500 bp,APP是350 bp,PS1是608 bp。PCR結(jié)果顯示,1號(hào)是Tau小鼠,2號(hào)和3號(hào)為T(mén)au/APP/PS1小鼠(圖1)。

Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products

2.2 大腦Tau、APP、PS1基因的轉(zhuǎn)錄

Tau為500 bp,APP為350 bp,PS1為608 bp。RTPCR結(jié)果顯示,1號(hào)是Wt小鼠,2號(hào)是Tau小鼠;3號(hào)是APP/PS1小鼠;4號(hào)是Tau/APP/PS1小鼠(圖2)。

Fig.2 Detection gene transcription in the brains of mice

2.3 海馬和皮層的Tau和Aβ蛋白表達(dá)量

取8月齡小鼠,Western blot結(jié)果顯示:4是Tau/APP/PS1小鼠的海馬及皮層,均有Tau和Aβ蛋白;3是APP/PS1小鼠的海馬及皮層,只有Aβ蛋白,2是Tau小鼠的海馬及皮層,只有Tau蛋白(圖3)。Tau蛋白量在Tau/APP/PS1和Tau小鼠的海馬和皮層無(wú)差異;Aβ蛋白量在Tau/APP/PS1小鼠的海馬高于APP/PS1小鼠29.6%,在皮層無(wú)差異(表1)。Tau/APP/PS1小鼠海馬Tau蛋白量高于皮層22.1%,皮層Aβ蛋白量高于海馬48.6%(表2)。

Fig.3 Expression of Tau and Aβ protein in 8-month transgenic mice(n=5)

Tab.1 Comparison of Tau and A β protein content in 8-month transgenic mice(±s,n=5)

Tab.1 Comparison of Tau and A β protein content in 8-month transgenic mice(±s,n=5)

*P＜0.05 vs APP/PS1

Protein type Mouse type Hippocampus Cortex Tau Tau 1.000±0.031 1.000±0.027 Tau/APP/PS1 1.053±0.125 1.029±0.314 Aβ APP/PS1 1.000±0.028 1.000±0.041 Tau/APP/PS1 1.296±0.264*0.865±0.276

Tab.2 Comparison of Tau and A β protein content in Tau/APP/PS1 transgenic mice(±s,n=5)

Tab.2 Comparison of Tau and A β protein content in Tau/APP/PS1 transgenic mice(±s,n=5)

*P＜0.05 vs Tau/APP/PS1

Protein type Hippocampus Cortex Tau 1.221±0.236 1.000±0.147*Aβ 0.673±0.235 1.000±0.179*

Fig.8 Escape latency in Tau/APP/PS1 triple transgenic mice of different months(±s,n=10)

2.4 海馬和皮層的神經(jīng)纖維纏結(jié)

取3、6和8月齡小鼠,F是8月齡Tau/APP/PS1小鼠的海馬和皮層 Bielschowsky染色可見(jiàn)火焰狀或球形的神經(jīng)纖維纏結(jié);E是8月齡的APP/PS1小鼠的海馬和皮層,未見(jiàn)此改變。箭頭所示為神經(jīng)纖維纏結(jié)(圖 4,5見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅰ)。

2.5 海馬和皮層的老年斑

取3、6和8月齡小鼠,C是 6月齡APP/PS1小鼠的海馬和皮層,ABC免疫組化可見(jiàn)少量老年斑;右D是6月齡Tau/APP/PS1小鼠皮層可見(jiàn)老年斑,而海馬沒(méi)有;E和F分別是8月齡的APP/PS1、Tau/APP/PS1小鼠的海馬和皮層,均可見(jiàn)老年斑。箭頭所示為老年斑(圖6,7見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅰ)

2.6 學(xué)習(xí)記憶的改變

取3、6和9月齡小鼠,Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示:6月齡Tau/APP/PS1小鼠逃逸潛伏期在第1、2、3天時(shí)分別為73.49±15.94(s)、59.16±14.96(s)、47.92±15.76(s),9月齡時(shí)在第2、3、4、5天時(shí)逃逸潛伏期分別為78.45±21.33、68.43±14.58、54.35±14.58、58.43±13.26,與Wt小鼠相比延長(zhǎng)(圖 8,P＜0.05)。

6月齡Tau/APP/PS1小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)為2.00±0.54,9月齡Tau/APP/PS1小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)為2.40±0.72,與Wt小鼠相比穿越平臺(tái)次數(shù)減少(圖9)。

3 討論

AD的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型包括單轉(zhuǎn)和多重(雙轉(zhuǎn)或三轉(zhuǎn))轉(zhuǎn)基因模型,多重轉(zhuǎn)基因模型比單轉(zhuǎn)模型的模擬AD病理變化和行為學(xué)改變特征的程度更高,逐漸成為研究AD的主流動(dòng)物模型。多重轉(zhuǎn)基因小鼠的建立方法有多種,主要通過(guò)雜交繁育、顯微共注射或同時(shí)運(yùn)用兩種方法。AD最常見(jiàn)的雙轉(zhuǎn)基因模型是APP/PS1小鼠,大多是轉(zhuǎn)入APPswe基因,但轉(zhuǎn)入PS基因片段會(huì)有多種選擇,此類(lèi)模型通常在6月齡發(fā)現(xiàn)Aβ蛋白沉積,9月齡出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙[5]。APP/Tau雙轉(zhuǎn)基因小鼠是首個(gè)能同時(shí)出現(xiàn)NFT和SP,模擬AD病理特征較為全面的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。由Tg2576小鼠和tau P301L(JNPL3)小鼠雜交而來(lái),名為T(mén)APP鼠[6],但常表現(xiàn)為體重減輕、后肢萎縮、彎腰駝背、發(fā)音和睜眼困難,其行為學(xué)改變因其身體狀況差而較難確定。APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因小鼠是先由單轉(zhuǎn)PS1M146V小鼠自交得到純合子,再分別將突變基因APPSwe和tauP301L顯微注射入純合子的胚胎干細(xì)胞,篩選而得[7];在6月齡出現(xiàn)認(rèn)知障礙和Aβ沉積;Aβ沉積出現(xiàn)在NFT之前,首先沉積在皮質(zhì),然后在海馬。12月齡出現(xiàn)NFT,是先海馬后皮質(zhì)。

Fig.9 Platform probe frequency in transgenic mice of different months(±s,n=10)

Jankowsky等[4]將由小鼠的朊蛋白啟動(dòng)子(Prp)啟動(dòng)的突變APP和PS1基因顯微共注射到小鼠受精卵中,構(gòu)建了APP/SP1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型,APP和PS1基因是整合在染色體的同一或相臨位置,即APP和PS1是連鎖的。6月齡APP/SP1小鼠腦內(nèi)可見(jiàn)老年斑,并有行為學(xué)改變。本實(shí)驗(yàn)室將帶有小鼠特異性的神經(jīng)元啟動(dòng)子Thy-1和含有P301L突變的人最長(zhǎng)Tau蛋白的異構(gòu)體,用雄原核顯微注射法,建立了Tau轉(zhuǎn)基因小鼠模型[3],能穩(wěn)定傳代,9月齡可見(jiàn)神經(jīng)元纖維纏結(jié)和有空間記憶力損害,12月齡有神經(jīng)元丟失。

本課題是將以上的Tau轉(zhuǎn)基因小鼠與APP/SP1轉(zhuǎn)基因小鼠雜交,建立Tau/APP/PS1三轉(zhuǎn)基因小鼠模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Tau/APP/PS1小鼠大腦可轉(zhuǎn)錄和表達(dá)Tau、APP和PS1三種外源基因;8月齡Tau/APP/PS1小鼠海馬Aβ蛋白高于APP/PS1小鼠29.6%,海馬Tau蛋白高于皮層22.1%,皮層Aβ蛋白比海馬高48.6%;8月齡海馬與皮層可觀察到大量的NFTs;6月齡皮層可見(jiàn)老年斑,比相同月齡的APP/PS1小鼠多;6月齡開(kāi)始記憶保持能力受損。提示,Tau/APP/PS1三轉(zhuǎn)基因小鼠中Tau基因的表達(dá)能促進(jìn)Aβ含量的增加;NFT先出現(xiàn)在海馬,SP則在皮層出現(xiàn)較早;Aβ沉積首先在皮層,而后到海馬。

本研究建立的Tau/APP/PS1三轉(zhuǎn)基因小鼠模型與Wengenack等人[5]建立的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠相比,增加了Tau病變;與Lewis等人[6]建立的APP/Tau雙轉(zhuǎn)基因小鼠相比,沒(méi)有大腦外的身體改變;與Oddo等人[7]建立的APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因小鼠有相似之處。此模型尚需傳代建系和深入研究其他生物學(xué)特征,并需要用染色體熒光原位雜交確定外源基因的插入位點(diǎn)。

AD的動(dòng)物轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因模型有多種,每一種模型都在一定的程度上或某些方面模擬AD的病理改變或癥狀,每種建立轉(zhuǎn)基因模型的方法各自具有相應(yīng)的適用范圍和作用,又各有優(yōu)勢(shì)與不足,但仍然沒(méi)有一種模型可以完全模擬完整的AD特征[8]。

目前國(guó)內(nèi)AD研究所用的Tau/APP/PS1三重轉(zhuǎn)基因小鼠全部依賴(lài)國(guó)外進(jìn)口,存在成本昂貴和外源基因易丟失等問(wèn)題。本研究所建立的Tau/APP/PS1三轉(zhuǎn)基因小鼠模型具有Tau和Aβ兩種病理改變和學(xué)習(xí)記憶障礙,為深入探究Tau與Aβ的關(guān)系、闡明AD的發(fā)病機(jī)制以及研發(fā)靶點(diǎn)治療藥物提供實(shí)驗(yàn)工具。

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