高效液相色譜法測定人血漿中酮咯酸濃度

劉雪松，慕楊娜，姜春梅，李國信

酮咯酸(Ketorolac)為吡咯酸的衍生物，屬非甾體抗炎藥，鎮痛作用近似阿司匹林，肌注后鎮痛作用近似中等量嗎啡。肝代謝產物羥基酮咯酸有抗炎、鎮痛作用，以原型由腎臟排泄。臨床用于緩解中度至重度的術后疼痛，及與外傷有關的急性腎絞痛和與癌癥有關的內臟疼痛等［1-2］。本實驗采用HPLC法測定人血漿中酮咯酸濃度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 LC-10ATvp高效液相色譜儀，SPD-10Avp紫外檢測器(LC solutionlite色譜工作軟件，日本島津公司)。酮咯酸氨丁三醇對照品(含量:99.72%，批號:ABBH002305)，奧硝唑原料藥(含量:99.4%，批號:090131069)，酮咯酸氨丁三醇膠囊(尼松，規格:10 mg/片，批號:090801，山東新時代藥業有限公司生產)，甲醇、乙腈(均為山東禹王實業有限公司化工分公司，色譜純)，磷酸二氫鈉(汕頭市西隴化工有限公司，分析純)，氫氧化鈉(沈陽市正信科技研究所試劑部，分析純)。

1.2 色譜條件 Platisil ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液-乙腈(70∶30)(2 mol/L氫氧化鈉調節pH值至5.14±0.01);檢測波長為 330 nm;流速為1.0 mL/min。

1.3 酮咯酸標準溶液及內標溶液配制 精密稱取酮咯酸氨丁三醇對照品適量(含量99.72%，約相當于酮咯酸10 mg)，置100 mL量瓶中，用50%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為100.0 μg/mL的酮咯酸儲備液;再用50%甲醇溶液逐級稀釋成質量濃度分別為24.8、49.6、99.2、248.0、496.0、992.0、2 480.0 μg/mL 的系列標準溶液。精密稱取奧硝唑原料藥適量(含量99.4%，相當于奧硝唑10 mg)，置100 mL量瓶中，50%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為100.0 μg/mL的內標儲備溶液，精密量取內標儲備液7.0 mL至100 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為7.0 μg/mL的內標溶液。

圖1 專屬性考察色譜圖

1.4 血漿樣品處理方法 取血漿樣品300 μL置1.5 mL離心管中，加入50%甲醇溶液30 μL，加入內 標 溶 液 (7.0 μg/mL 奧 硝 唑)30 μL，甲 醇900 μL，渦旋60 s，離心8 min(15 000 r/min)，取出上清液400 μL置5 mL離心管中，40℃水浴中空氣流下吹干，用400 μL流動相復溶，渦旋混合60 s，離心 5 min(15 000 r/min)，取上清液 50 μL進行分析。

2 結果

2.1 專屬性考察 酮咯酸和內標保留時間分別為11.6 min和8.6 min。酮咯酸和內標奧硝唑分離度良好，血漿中內源性物質不干擾測定，色譜圖見圖1。

2.2 線性關系 精密量取空白血漿300 μL置1.5 mL離心管中，分別加入不同濃度的酮咯酸標準溶液各30 μL，配制成血漿中酮咯酸濃度為24.8、49.6、248.0、496.0、992.0 和 2 480.0 ng/mL的血漿樣品，按“1.4”項下方法操作，制備酮咯酸標準曲線，進行雙樣本分析。以酮咯酸濃度(ng/mL)為橫坐標X、酮咯酸與內標物的峰面積比值(As/Ai)為縱坐標Y，用加權最小二乘法(權重系數:1/X2)進行線性回歸運算，求得的線性回歸方程為 Y=-0.007 27+0.002 76X，r=0.999 7。結果表明，酮咯酸在24.8～2 480.0 ng/mL范圍內線性關系良好。

2.3 精密度與準確度 精密量取空白血漿300 μL置1.5 mL離心管中，分別精密加入不同濃度的酮咯酸質控樣品溶液各30 μL，配制成血漿中酮 咯 酸 為 69.4(QC1)、396.8(QC2)、1 984.0(QC3)ng/mL的血漿樣品，按“1.4”項下方法操作，連續制備并測定3 d，每日低、中、高3個濃度，每個濃度進行6樣本分析，計算批內和批間的精密度(RSD)，結果見表1。

表1 精密度以及準確度

2.4 提取回收率的考察 精密量取空白血漿300 μL置1.5 mL離心管中，分別精密加入不同濃度的酮咯酸質控樣品溶液各30 μL，配制成血漿中酮咯酸為 69.4(QC1)、396.8(QC2)、1 984.0(QC3)ng/mL的血漿樣品，每個質量濃度進行6樣本分析，將各色譜峰面積與相應質量濃度的標準溶液直接進樣獲得的色譜峰面積比較，計算本方法提取回收率，酮咯酸低、中、高3個濃度的回收率分別為 91.5% ±4.8%、95.7% ±1.6%和93.4% ±2.3%，內標回收率為90.5% ±3.2%。2.5 樣品的穩定性 按“1.4”項下方法制備質量濃度分別為69.4和1 984.0 ng/mL的對照品血漿樣品各21份。分別考察其在室溫、凍融循環以及處理后樣品在室溫、冷凍條件下的穩定性，當日隨行標準曲線計算血漿樣品中酮咯酸的濃度，將測定濃度的平均值與理論濃度對照，所有測定結果偏差都在15%以內，表明血漿樣品在室溫放置7 h、血漿樣品處理后室溫放置25 h、血漿樣品提取吹干后冷凍放置49 h、血漿樣品3次冷凍-解凍循環條件下穩定性良好。

2.6 藥動學研究中的應用 24名健康男性志愿受試者進食后30 min口服單劑量實驗試劑20 mg，分別于給藥前及給藥后0.167(10 min)、0.333(20 min)、0.50(30 min)、0.75(45 min)、1.00、1.50、2.00、3.00、5.00、8.00、12.0、16.0、24.0 h 取靜脈血，每一階段總計取14個點(每點采血5 mL，遮光)，測定口服實驗試劑后血漿中酮咯酸的濃度。采用Phoenix WinNonlin 6.0數據統計軟件計算24名健康志愿者口服單劑量試驗制劑20 mg的主要藥動學參數，結果見表2。

表2 24名健康志愿者口服單劑量酮咯酸氨丁三醇膠囊20 mg的主要藥動學參數

3 討論

3.1 提取條件考察 實驗過程中考察10%三氯醋酸沉淀法處理血漿樣品，由于化合物對pH值敏感，血漿酸化處理后，待測物保留時間不穩定，有干擾峰，影響定量分析。改用甲醇900 μL處理樣品后吹干濃縮，以流動相復溶，提高了低點濃度的響應值，避免了溶劑效應，提高了柱效，基線平穩，無內源性雜質干擾。

3.2 內標物選擇 本實驗分別應用酮咯芬、替硝唑等化合物作為內標物質，結果奧硝唑出峰時間合適，峰形良好。奧硝唑出峰時間對流動相的pH值敏感，可以通過調整流動相的pH值來調整化合物和內標的出峰位置，排除內源性物質的干擾。

3.3 檢測波長確定 文獻中大多選取315 nm為檢測波長［3］，本實驗中對酮咯酸氨丁三醇進行紫外掃描，發現其最大吸收波長為322 nm，并且在330 nm處仍有較強吸收，本實驗最終確定檢測波長為330 nm，進一步減少了內源性物質的干擾。波長掃描圖見圖2。

圖2 酮咯酸氨丁三醇紫外波長掃描圖

3.4 待測組分確定 酮咯酸氨丁三醇進入人體后迅速分解為活性物質酮咯酸［4］，由于沒有市售酮咯酸對照品，只能采用酮咯酸氨丁三醇的對照品。本實驗為了證明氨丁三醇不干擾待測物酮咯酸的檢測，對氨丁三醇(2 mg/mL)進行了紫外掃描，結果顯示，氨丁三醇在波長190～200 nm處有明顯吸收，在330 nm處無吸收。因此，本實驗中氨丁三醇不干擾待測物的檢測。波長掃描圖見圖3。

圖3 氨丁三醇紫外波長掃描圖

3.5 藥動學 Tmax和 Cmax與文獻報道有差異［5］，文獻報道禁食12 h后口服單劑量10 mg藥物的Cmax為810 ng/mL，根據藥動學線性關系計算單劑量給藥20 mg后，Cmax應為1 620 ng/mL，而本實驗為(1 351.7±310.9)ng/mL。此外，本實驗中Tmax為(1.86±0.58)h與文獻中的(0.89±0.63)h相差大約1 h。原因可能是食物減少了酮咯酸的吸收并延后了達峰時間。

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［1］陳陽，李建揚，吳興林，等.酮咯酸氨丁三醇注射液用于急診疼痛鎮痛體會［J］.河北醫藥，2010，32(12):1611.

［2］Nagilla R，Deshmukh DD，Copedge KJ，et al.Enantiomeric disposition of ketorolac in goats following administration of a single intravenous and oral dose［J］.J VET Pharmacol Ther，2009，32(1):49-55.

［3］徐帆，余昉，尚北城.高效液相色譜法測定人尿中酮咯酸含量［J］.中國藥房，2007，18(5):340-341.

［4］Raju B，Ramesh M，Borkar RM，et al.Development and validation of liquid chromatography-mass spectrometric method for simultaneous determination of moxifloxacin and ketorolac in rat plasma:application to pharmacokinetic study［J］.Biomed Chromatogr，2012，23(5):259-265.

［5］McAleer SD，Majid O，Venables E，et al.Pharmacokinetics and safety of ketorolac following single intranasal and intramuscular administration in healthy volunteers［J］.J Clin Pharmacol，2007，47(1):13-18.