安陽(yáng)固本膏中血竭素的HPLC含量測(cè)定

李長(zhǎng)達(dá)

安陽(yáng)固本膏具有溫腎暖宮，活血通絡(luò)的功效，主要用于女子宮寒不孕，經(jīng)前腹痛，月經(jīng)不調(diào);男子精液稀薄，精子少，腰膝冷痛等的治療。安陽(yáng)固本膏是由肉桂、附子、艾葉、血竭等23味中藥經(jīng)提取分離后制成的中藥復(fù)方制劑，而血竭［1］為傳統(tǒng)名貴中藥，具有活血定痛，化瘀止血，生肌斂瘡的功效，血竭中含有黃酮類、苷類、酚類、有機(jī)酸等多種化學(xué)成分，其中血竭素是其主要藥效成分之一。現(xiàn)以血竭素的含量為指標(biāo)，采用HPLC法對(duì)方中血竭進(jìn)行測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 1525系列高效液相色譜儀(1525 HPLC泵，2487雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器);BP211D電子天平。

1.2 試藥 血竭素高氯酸鹽對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供);3批安陽(yáng)固本膏樣品(市售);乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 血竭素的含量測(cè)定

2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱(200 mm×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相:乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(45∶55);流速:1.0 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):440nm;進(jìn)樣量:10.0 μl;柱溫:30℃。在上述色譜條件下，分別取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液進(jìn)樣，結(jié)果對(duì)照品溶液與供試品溶液在相同的保留時(shí)間處有吸收峰，而陰性對(duì)照溶液無(wú)吸收峰。見(jiàn)下圖。

圖1 HPLC圖

2.2 溶液配制 對(duì)照品溶液的制備:精密稱取血竭素高氯酸鹽對(duì)照品，加3%磷酸甲醇溶液制成每1 ml含血竭素10 μg(血竭素重量=血竭素高氯酸鹽重量/1.377)的溶液，作為對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備:取剪碎的本品15 g，加硅藻土2 g，加入3%磷酸甲醇溶液50 ml，加熱回流30 min，冷卻，濾過(guò)(0.45μm微孔濾膜)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

陰性對(duì)照溶液的制備:取按處方及工藝制備的不含血竭藥材的樣品，按供試品溶液的制備同法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 線性試驗(yàn) 精密稱取血竭素對(duì)照品適量，加3%磷酸甲醇溶液溶解并分別制成每 1 ml含 4.357 μg、6.536 μg、8.715 μg、13.072 μg、26.144 μg 的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定。以濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:Y=3113380X-17807(r=0.9998)，表明血竭素在0.04357～0.26144 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密度試驗(yàn):取血竭素對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定5次，得峰面積值的RSD為0.8%。

重現(xiàn)性試驗(yàn):取同一批樣品，共6份，照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試溶液，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得含量的RSD為0.6%。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，按上述色譜條件，于配制后第 0、1、2、3、4 h分別進(jìn)樣測(cè)定，得峰面積值的 RSD為0.9%。

2.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的同一批號(hào)安陽(yáng)固本膏樣品(含量為0.035 mg/g)6份，研細(xì)，取適量，精密稱定，分別精密加入定量的血竭素對(duì)照品溶液(濃度為0.0255 mg/ml)。按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。得加樣回收率為97.8%，RSD=0.4%(n=6)。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表

2.6 樣品測(cè)定 取3批安陽(yáng)固本膏樣品，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定血竭素含量。結(jié)果3批安陽(yáng)固本膏樣品每張含血竭素的平均含量分別為0.81 mg、0.74 mg、0.85 mg。

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇 實(shí)驗(yàn)分別比較了用甲醇、三氯甲烷-甲醇(1∶1)、三氯甲烷、3%磷酸甲醇溶液［2］等為提取溶劑，結(jié)果以3%磷酸甲醇溶液提取率最高，故最后確定采用3%磷酸甲醇溶液為提取溶劑。

3.2 提取方法的選擇 實(shí)驗(yàn)分別采用超聲處理30 min、1 h，加熱回流30 min、1 h進(jìn)行提取［3］，結(jié)果以加熱回流30 min提取效果最佳，故最后確定采用加熱回流30 min進(jìn)行提取。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典.一部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:133.

［2］蘇健，王寶琴，韓敏彩，等.進(jìn)口與國(guó)產(chǎn)血竭含量測(cè)定方法研究進(jìn)展.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2005，12(1):49-50.

［3］邱碧菡，陳軍霞，卞凌，等.血竭中血竭素的提取方法比較.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(7):22-24.