花生及其制品中多種霉菌毒素殘留同時測定方法*

朱臻怡 ，宋歡 ，馮民 ，何健 ，熊華萱

(1中華人民共和國淮安出入境檢驗檢疫局，江蘇淮安 223001；2中華人民共和國山西出入境檢驗檢疫局，太原 030024)

霉菌毒素(Mycotoxins)是一類存在于自然界中的各種霉菌產生的有毒次級代謝產物，廣泛污染農作物、食品及飼料等植物源性產品[1]，是花生及其制品的重要污染源之一，從而進入食物鏈中影響人體健康[2]。隨著農產品受霉菌毒素污染問題的日趨嚴重和食品安全問題的國際化，發達國家和有關組織對花生及其制品中霉菌毒素殘留紛紛制定了嚴格的限量標準[3]。花生作為我國在國際市場具有相對競爭優勢的農產品，其出口遭受到了一系列SPS措施的阻礙[4]，其中霉菌毒素殘留限量標準日趨嚴厲，檢測項目不斷增加。因此花生及其制品中霉菌毒素殘留檢測對于保障人民飲食健康，保障我國花生及其制品的進出口貿易具有重要意義。

目前在我國，霉菌毒素是出口花生及其制品的殘留監控的一個重要項目[5]，對于霉菌毒素的殘留分析，國內外報道較多的是僅針對每個毒素的包括薄層層析法、液相色譜法和免疫化學分析法(有免疫親和柱-熒光分光光度法和免疫親和術-HPLC法、酶聯免疫吸附法、微柱篩選法和一步式檢測金標試紙法)等檢測手段[6]，國家標準和行業標準中也有相關測定方法規定，但對多種霉菌毒素的同時測定尚沒有相關的標準方法。國外報道Veronica Maria Teresa Lattanzio等[7]利用液相色譜-串聯質譜法對玉米中多種霉菌毒素及其代謝產物同時檢測，但提取凈化手段繁瑣或效果不佳，基質單一，不適合于開展日常的檢測。筆者利用液相色譜-串聯質譜技術對花生及其制品中多種霉菌毒素同時測定，以PBS溶液和甲醇-水溶液提取，經免疫親和柱凈化的手段，有效地降低了花生本底干擾，提高了檢測靈敏度，可滿足殘留檢測和目前國外檢測限量(MRL)的需要，提高了目前花生及其制品中多種霉菌毒素殘留的檢測能力。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

甲醇、乙腈、甲苯、乙酸：色譜級，德國Merck公司；

PBS溶液：北京中檢維康技術有限公司；

霉菌毒素標準品：美國Sulpco公司和美國Vicam公司；

免疫親和柱：Myco6in1TMLC／MS／MS型，美國VICAM公司；

液相色譜-質譜／質譜儀：ACQUITY TQ Detector，配有電噴霧離子源(ESI)，美國 Waters公司；

電子天平：PB-203E型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

恒溫氮吹裝置：N-EVAP14165型，美 國Organomation聯合公司。

1.2 液相色譜-質譜／質譜分析條件

色譜柱：ACQUITY UPLC反 相C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；離子化模式：電噴霧電離正離子模式(ESI+)和電噴霧電離負離子模式(ESI-)，一次進樣；質譜掃描方式：多反應監測(MRM)；其它質譜條件：見表1；流動相：乙腈和10 mmol／L乙酸銨溶液梯度洗脫，見表2,流速為0.4 mL／min ；柱溫：35℃；進樣量：5 μL。

1.3 樣品預處理

樣品經花生粉碎機粉碎成均勻的試樣。

表1 多反應監測方法(MRM)測定的質譜條件參數

表2 梯度洗脫程序

1.3.1 提取

稱取5 g試樣(精確到0.01 g)置于50 mL具塞塑料離心管中，加入PBS溶液25 mL，超聲振蕩15 min后以4000 r／min離心10 min。取上層17.5 mL PBS溶液于干凈的容器，通過微纖維濾紙過濾，將濾液收集于干凈的容器(提取液A)。向下層固體樣品中加入17.5 mL甲醇，超聲振蕩15 min后以4000 r／min離心10 min，取上層溶液10 mL，用90 mL PBS溶液稀釋后通過微纖維濾紙過濾，將濾液收集于干凈的容器(提取液B)。

1.3.2 免疫親和柱凈化和洗脫

將免疫親和柱連接于10 mL玻璃針筒下，準確移取50 mL提取液B過免疫親和柱，以每秒1～2滴的流速全部通過親和柱，直至空氣流經親和柱；將20 mL PBS溶液以每秒1～2滴的流速通過親和柱，直至空氣流經親和柱；準確移取5 mL提取液A以每秒1～2滴的流速全部通過親和柱，直至空氣流經親和柱；將20 mL超純水以每秒1～2滴的流速淋洗柱子，直至空氣流經親和柱，棄去全部流出液。將1.5 mL甲醇以每秒1滴的流速洗脫親和柱，將洗脫液收集于玻璃試管中，當甲醇大部分過柱后，不要完全過柱，停止加壓，靜置5 min，再將1.5 mL甲醇以每秒1滴的流速洗脫親和柱，將全部洗脫液收集于同一玻璃試管中。

1.3.3 定容

將上述收集于玻璃試管中的洗脫液在50℃下氮氣吹干，加入0.5 mL體積比為1∶1的水-乙腈溶液(相當于1 g樣品)，充分渦旋混合后，過0.22 μm有機濾膜，用液相色譜-質譜／質譜儀測定。

2 結果與討論

2.1 提取過程

在優化提取試驗過程中，采用回收試驗比較了單個提取[用PBS溶液或70%甲醇-水(體積比為7∶3)溶液]和雙重提取[先用PBS溶液提取，再用70%甲醇-水(體積比為7∶3)溶液提取，合并兩份提取液]的效果，表明雙重提取更為充分徹底，能得到較高的回收率，尤其是伏馬毒素B1和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，需要雙重提取來完善提取過程。

2.2 凈化和洗脫過程

實驗所用Myco6in1TMLC／MS／MS免疫親和柱[8]的優點是具有高度的特異性，使用時不需要活化，但是上樣時有機溶劑的含量應嚴格控制，甲醇和乙腈等有機溶劑的體積分數不能超過20%，否則會影響毒素的抗原抗體結合反應。

雖然免疫親和柱具有選擇性吸附的特性，但是樣品基質中，某些具有生物活性的雜質也會有少量吸附，為了消除這些雜質，實驗選擇用真菌毒素緩沖液來淋洗，一可以去雜質，二可以痊愈脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(脫氧雪腐鐮刀菌烯醇親水性較強)[9]，對復雜的樣品基質能達到非常好的凈化效果，而單純用純水淋洗，雜質的去除效果不好，易干擾測定。

將1.5 mL甲醇以1滴／秒的流速淋洗親和柱，收集淋洗液時當大部分甲醇過柱(不要完全過柱)后，停止加壓，靜置5 min，以確保洗脫完全；再用1.5 mL甲醇以1滴／秒的流速淋洗親和柱，收集全部淋洗液，此次確保洗脫徹底。

在對樣品凈化過程研究中發現，由于脫氧雪腐鐮刀菌烯醇親水性強，過柱的PBS溶液中含甲醇的質量分數和溶液的體積對它的回收有較大的影響，因此在70%甲醇-水(體積比為7∶3)提取液過柱后和PBS提取液過柱前要用PBS溶液20 mL淋洗柱子，以痊愈脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。

2.3 儀器條件

根據固定相的適用范圍和擬分析霉菌毒素的結構特性，采用ACQUITY UPLC反相C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7μm)，進行樣品分析，柱效高，分離效果好。

由于采用電噴霧(ESI)模式，為了利于去溶劑化，選擇乙腈為流動相中的有機相；為改善色譜分離效果，提高質譜響應，向流動相的水相中添加乙酸和乙酸銨，最佳配比為0.1%乙酸(體積比)和10 mmol／L乙酸銨。

2.4 方法的線性范圍與檢出限

在本方法所確定的實驗條件下，以信噪比(S／N)為10時的檢測濃度作為檢出限，用含0.5%甲酸(體積比)和10 mmol／L乙酸銨的水溶液將配制的混合標準溶液稀釋成1，2，5，10，20倍檢出限的系列標準溶液，進行測定，以峰面積y(縱坐標)對相應霉菌毒素的濃度x(橫坐標)作圖，結果表明，待測化合物濃度與對應的峰面積呈現良好的線性關系，線性方程、線性范圍及檢出限見表3。

表3 方法的檢出限和線性方程、線性范圍

2.5 方法的回收率與精密度

本方法的室內回收率和精密度試驗，以不含以上各霉菌毒素的花生為空白樣品基質，進行1倍檢出限濃度水平的添加回收試驗，平行測定10次，結果見表4。實驗結果表明，方法平均回收率為72.35%～97.82%，相對標準偏差為8.95%～18.41%。表4中回收率與精密度數據符合國家規定殘留分析對準確度與精密度的要求，說明本方法具有較好的可靠性與可行性。

表4 樣品中添加霉菌毒素的回收率及精密度試驗結果

續表4

空白樣品譜圖及檢出限添加水平的黃曲霉毒素B2譜圖分別見圖1、圖2。

3 結語

采用多種霉菌毒素免疫親和柱凈化的以LC／ESI-MS／MS方式同時測定花生及其制品中黃曲霉毒素(B1，B2，G1，G2)、赭曲霉毒素 A、伏馬毒素 B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2毒素、HT-2毒素和玉米赤霉烯酮。方法所涉及的相關霉菌毒素的測試水平的回收率和重現性等技術指標均符合國內外相關要求；該方法的檢出限滿足國內、國際對上述霉菌毒素已規定或正在制定的最大允許水平要求，能夠滿足實際應用的需要。

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