UPLC–MS–MS法測定血液中5種吩噻嗪類藥物

趙蒙，王朝虹，劉勇，呂俊崗

(最高人民檢察院檢察技術信息中心，北京 100040)

吩噻嗪及其衍生品一般稱為吩噻嗪類，它能抑制中樞神經系統，具有安眠鎮靜、鎮痛等作用，被廣泛用作治療精神病藥物，抑制由于藥物、癌癥等引起的嘔吐，也用于增強麻醉、催眠、鎮痛的效能。然而吩噻嗪類藥物吸收迅速且易在體內代謝和分解，體液中藥物的原型含量很低，特別是在服藥18 h后，分布在體內的原藥甚少[1]。因此，此類藥物分析方法的靈敏度和準確度尤為重要。

目前國內外對體內吩噻嗪藥物的檢驗方法有固相萃取 – 氣相色譜法[1]、超高效液相色譜法[2–4]等，但這些方法存在靈敏度低、樣品檢驗過程復雜、分析時間長、陽性結果還需驗證等問題。近年來，液質聯用法已成為檢測各類藥物的主要方法，特別是液相色譜–串聯質譜法，由于其良好的適用性、定性定量功能及高靈敏度，而被廣泛應用于司法鑒定、臨床等領域中。筆者建立了血液中5種常見吩噻嗪藥物的分析方法，該法快速、穩定、前處理簡單、靈敏度高，可有效地應用于法醫毒物和臨床檢測。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜串聯四級桿質譜聯用儀：TQ–S型，美國沃特世公司；

離心機：Blofuge Primo型號，美國Thermo公司；

震蕩器：CUTE MIXER CM–1000型，日本EYELA公司；

甲酸：HPLC級，美國Fisher Scientific公司；

空白血：紅十字會血站；

甲醇、乙腈：LC–MS級，美國Fisher Scientific公司；

固相萃取柱：Waters Oasis HLB，30 μm，1 mL／20 mg，美國沃特世公司；

去磷脂板：Ostro 96孔磷脂去除板，美國沃特世公司；

正壓提取裝置：Positive Prssure–96型，美國沃特世公司；

異丙嗪、泰爾登、氯丙嗪、奮乃靜、三氟拉嗪5種吩噻嗪類標準樣品：1 mg／mL的甲醇溶液，北京百靈威科技有限公司；

實驗用水為Millipore milli–Q Integal 3型高純水機制。

1.2 液相色譜–串聯質譜條件

(1)色譜條件

色譜柱：ACQULTY UPLC HSS SB C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美國waters公司)；流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液；柱溫：35℃；流速：0.5 μL／min ；進樣量：5 μL ；梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

(2)質譜條件

質譜條件：電噴霧離子源(ESI)正離子模式；多反應監測(MRM)模式；毛細管電壓：0.5 kV；去溶劑氣溫度：500℃；去溶劑氣流速：800 L／h；碰撞氣流速：0.16 mL／min；5種吩噻嗪類藥物的質譜采集參數見表2

1.3 樣本提取方法

取1 mL血樣，加入3 mL 2%甲酸乙腈溶液(4℃冷藏)，渦旋震蕩10 min，離心10 min兩次(8000 r／min)，取上清液裝瓶，待用。

2 結果與討論

2.1 質譜條件

用儀器IntelliStart功能，通過蠕動泵將濃度為100 ng／mL的5種吩噻嗪標準液以流速20 μg／mL注射到ESI離子源中。在正離子檢測模式下對5種藥物進行一級質譜母離子(m／z)分析，得到了準分子離子峰(M+1)；對準分子離子峰進行二級質譜子離子(m／z)分析，自動得到離子碎片信息；選擇基線噪音低、響應值高的離子對作為監測離子對；采用多反應監測模式采集數據，并優化各離子對的錐孔電壓 Cone(V)、碰撞能電壓 Collision(eV)、毛細管電壓Capillary(kV)及去溶劑氣流速、溫度等，確定了1.2(2)的質譜條件。色譜圖見圖1。

表2 5種吩噻嗪類藥物的MS–MS參數

2.2 流動相

分別選用3種流動相0.1%甲酸水溶液、2%氨水水溶液及pH 10的5 mmol／L碳酸氫銨水溶液，用HSS柱分析5種吩噻嗪類藥物，比較其響應值，圖2為不同流動相及柱子對吩噻嗪類藥物的響應變化。由圖2可知，選用流動相為0.1%甲酸水溶液通過HSS柱分析后5種吩噻嗪類藥物的響應較高，且無干擾，因此采用0.1%甲酸水溶液為流動相。

2.3 樣本前處理、基質效應、添加回收率的考察

分別選用過HLB小柱固相萃取、酸化乙腈沉淀蛋白及利用Ostros 96孔板去除磷脂法3種不同的前處理方法，通過提取前、后添加法，按照文獻[5]中所述，比較標準品溶液的信號峰面積(Set1)、不同來源基質提取后加標的信號峰面積(Set2)及基質提取前加標的信號峰面積(Set3)?；|效應=Set2／Set1；加標回收率=Set3／Set2。這種考察方法可量化評價基質效應，同時也考察方法的提取回收效率。分別考察高、中、低(0.02，2，20 ng／mL)3個濃度級別、平行6組操作，試驗結果見表3。由表3可知，經酸化乙腈沉淀蛋白提取后的樣本提取回收率高、基質效應小，且此提取方法操作簡單、成本低、穩定性好，測定結果準確，因此選用酸化乙腈沉淀蛋白提取樣品。

表3 3種不同前處理方法的比較

2.4 線性方程及檢出限

在空白血樣中添加不同濃度的5種吩噻嗪類的對照品溶液，濃度分別為 0.01，0.02，0.05，0.2，2，20 ng／mL的血液樣品，血樣中5種吩噻嗪類藥物的質量濃度x在0.05～20 ng／mL濃度范圍內與峰面積y呈良好的線性關系。異丙嗪、泰爾登、氯丙嗪、奮乃靜、三氟拉嗪的檢出限分別為0.02，0.01，0.01，0.01，0.01 ng／mL。血液中5種吩噻嗪類藥物的線性范圍，線性方程，相關系數，檢出限見表4。

2.5 精密度試驗

在空白血樣中添加不同量的5種吩噻嗪類的混合對照品，得到一系列濃度為0.02，2，20 ng／mL的血液樣品，每個濃度點做6個平行樣本進行操作，每天監測10次，連續測定3 d，用峰面積計算日內、日間的相對標準偏差，結果見表5。

表4 血液中5種吩噻嗪類藥物的線性范圍、線性方程、檢出限

表5 血液中5種吩噻嗪藥物方法的日內、日間精密度

由表5可知，測定結果的相對標準偏差小于7%，說明本方法的精密度較高。

3 結語

采用UPLC–MS–MS法同時檢測血液中5種吩噻嗪類藥物，該法操作簡單、靈敏度高、基質效應低、準確可靠，適用于臨床和法醫毒物中的檢測鑒定。

[1]王芳林，劉耀，封世珍，等.生物體內吩噻嗪藥物的分析[C]//第五次全國法醫學術交流會論文集.北京，1996: 333–335.

[2]Maria Addolorata Saracino，Mario Amoreb，Elena Baioni.Determination of selected phenothiazines in human plasma by solid-phase extraction and liquid chromatography with coulometric detection[J]. Analytica Chimica Acta，2008，624: 308–316.

[3]Garratt W Ponder，Sandra L Butram，Amanda Adams.Resolution of promethazine，ethopropazine，trimeprazine and trimipramine enantiomers on selected chiral stationary phases using high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography A，1995，692: 173–182.

[4]Einosuke Tanaka，Takako Nakamura，asaru Terada，et al. Simple and simultaneous determination for 12 phenothiazines in human serum by reversed-phase high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography B，2007，854: 116–120.

[5]Matuszewski B K，Constanzer M L，Chavez-Eng C M.Strategiesfor the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC–MS／MS [J]. Anal Chem，2003，75: 3019–3030.