固相微萃取氣相色譜法測定飲料中山梨酸和苯甲酸*

董春洲，吳萍

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)衛(wèi)檢教研室， 武漢 430065)

山梨酸和苯甲酸作為防腐劑廣泛應(yīng)用于飲料等食品中，我國食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)對食品添加劑的生產(chǎn)和使用都作出嚴(yán)格規(guī)定。有關(guān)食品中山梨酸和苯甲酸測定的國家標(biāo)準(zhǔn)方法主要是氣相色譜法(GC)和高效液相色譜法(HPLC)。HPLC儀價格昂貴，在基層難以普及；GC因廉價被普遍采用，但GC對食品中山梨酸和苯甲酸測定前需進(jìn)行多次萃取和純化，操作過程繁瑣、耗時，且影響測定結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度。

最早由Pawliszyn提出的固相微萃取(SPME)是一種無溶劑的簡便萃取濃縮技術(shù)[1]，這項(xiàng)技術(shù)與氣相色譜(GC)聯(lián)用，使樣品處理與氣相色譜進(jìn)樣合二為一。SPME包括直接(ID)和頂空(HS)兩種操作技術(shù)，它是將被分析成分吸附在有特定涂層的石英纖維探頭上，然后在氣相色譜進(jìn)樣口內(nèi)高溫解吸，被分析成分隨載氣進(jìn)入色譜柱而得到分離。SPME–GC已被應(yīng)用于環(huán)境、醫(yī)藥和食品中揮發(fā)性及半揮發(fā)性物質(zhì)的測定。賈金平等用液–液萃取后再用固相微萃取的方法測定了醬油中的苯甲酸[2]，但仍然沒有避免液–液萃取的繁瑣。國內(nèi)尚未見SPME一步完成樣品處理測定食品中山梨酸和苯甲酸的報(bào)道。筆者對HS–SPME–GC測定食品中山梨酸和苯甲酸進(jìn)行過研究[3–4]。在前期研究不分流／分流毛細(xì)管GC法測定山梨酸和苯甲酸[5]基礎(chǔ)上，筆者采用國內(nèi)研制的聚甲基苯基乙烯基硅氧烷(PMPVS，俗稱 SE–54)溶膠凝膠涂層萃取頭[6]，首次用ID–SPME–GC測定飲料中山梨酸和苯甲酸。由于溶膠凝膠涂層具有多孔性，表面積大，富集作用強(qiáng)，靈敏度比傳統(tǒng)的液–液萃取氣相色譜法高，因此該方法簡便、快速，不需使用有害人體健康的有機(jī)溶劑，有較高的應(yīng)用價值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜儀：GC7890Ⅱ型，配FID檢測器和分流／不分流進(jìn)樣器，上海天美公司；

色譜工作站：SePu3000型，杭州譜惠公司；

純凈空氣泵、氫氣發(fā)生器：QL型，山東濟(jì)南應(yīng)用化工科技開發(fā)公司；

高純氮?dú)猓?9.999%，武漢鋼鐵公司；

氣體脫氧管：BS–2L型，中國科學(xué)院大連化物所；

SE–54溶膠凝膠涂層萃取頭：65 μm，武漢大學(xué)；

山梨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：編號為GBW(E)100007，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；

苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：編號為GBW(E)100006，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；

山梨酸、苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：20 mg／mL,分別準(zhǔn)確稱取山梨酸和苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)100 mg，置于5 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容至刻度，使用時根據(jù)需要，用無水乙醇稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)使用液；

無水乙醇、鹽酸、氯化鈉：分析純。

1.2 色譜條件

色譜柱：FFAP石英毛細(xì)管柱(30m×0.32 mm，0.5 μm，中國科學(xué)院蘭州化物所)；柱溫：起始230℃，以5℃／min升至240℃，保持6 min；進(jìn)樣口溫度：260℃；檢測器溫度：250℃；載氣：高純氮經(jīng)凈化管后再經(jīng)脫氧管脫氧，流速72 mL／min；柱前壓：150 kPa；尾吹氣流速：22 mL／min；進(jìn)樣方式：不分流，0.3 min后再自動轉(zhuǎn)換為分流，分流比為 26∶1。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

(1)直接固相微萃取氣相色譜法

萃取頭使用前先在氣相色譜進(jìn)樣口于260℃活化1 h。在一個12 mL安瓿瓶中，加20 μL 5 mg／mL山梨酸和苯甲酸混合標(biāo)準(zhǔn)容液、5 mL蒸餾水和5 mL 1 mol／L HCl，3.0 g NaCl，混勻。加一顆攪拌磁子，將藏有固相微萃取頭的微量注射器針頭插入瓶內(nèi)液面以下，將萃取頭向下推出完全浸泡在溶液中,然后在500 r／min磁攪拌條件下萃取30 min。完成萃取后，將萃取頭再縮回針頭內(nèi)。萃取頭于氣相色譜進(jìn)樣口內(nèi)260℃解吸5 min，被測成分解吸后隨載氣進(jìn)入色譜柱進(jìn)行分離，經(jīng)氫火焰離子化檢測器測定。在此條件下，苯甲酸和山梨酸混合溶液的色譜圖見圖1。

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別取 0.10，0.50，1.0，5.0，10，20 mg／mL 山梨酸和苯甲酸混合標(biāo)準(zhǔn)液20 μL于12 mL安瓿瓶中，加 10 mL 0.5 mol／L HCl，3.0 g NaCl，混勻。標(biāo)準(zhǔn)系列測定液中山梨酸和苯甲酸的系列濃度均為0.2，1.0，2.0，10，20，40 μg/mL。按上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行ID–SPME–GC測定。以峰面積為縱坐標(biāo)，以山梨酸和苯甲酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(3)樣品測定

取飲料(碳酸飲料先溫?zé)岢鼵O2)或冰糖雪梨(罐頭)水1.0 mL于12 mL安瓿瓶中，加蒸餾水4.0 mL，1 mol／L 鹽酸 5 mL，混勻。按上述方法進(jìn)行ID–SPME–GC測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件的優(yōu)化

(1)萃取時間

在常溫條件下，試驗(yàn)了10～60 min范圍內(nèi)的萃取效率，萃取時間與色譜峰面積的關(guān)系見圖2。由圖2可知，30 min后，萃取效率隨時間的延長提高的較慢，因此選擇萃取時間為30 min。

(2)氯化鈉用量

中性鹽可降低有機(jī)物在水中的溶解度，從而提高被測成分的萃取效率。分別加0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0 g氯化鈉進(jìn)行固相微萃取試驗(yàn)，當(dāng)加入3.0 g 氯化鈉時，響應(yīng)值最大；加4.0 g氯化鈉時，溶液中有很多未溶解的固體氯化鈉，降低了磁轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速，萃取效率低。實(shí)驗(yàn)選擇氯化鈉用量為3.0 g。

(3)酸度

酸性條件可降低山梨酸和苯甲酸的離解度，有利于提高萃取效率，分別對 0.1，0.5，1.0，1.5，2.0 mol／L鹽酸進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，鹽酸濃度為0.5 mol／L時，萃取效率最高。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)鹽酸濃度為1.0 mol／L時，有明顯的固體氯化鈉析出，這可能是鹽酸濃度升高使萃取效率降低的原因。

2.2 工作曲線方程

對1.3(2)中的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行測定，以色譜峰面積Y，對被測物的濃度X(μg／mL)進(jìn)行線性回歸，兩種被測物的濃度X在0.2～40 μg／mL的范圍內(nèi)(按實(shí)驗(yàn)方法，取1.0 mL樣品稀釋至10 mL進(jìn)行測定，換算成樣品中含量范圍為0.002～0.4 g／L)有良好的線性關(guān)系。其中山梨酸的線性回歸方程為Y=15647X＋3400.2，相關(guān)系數(shù)r=0.9988；苯甲酸的線性回歸方程為Y=14882.5X＋2356.6，相關(guān)系數(shù)r=0.9989。可見該方法可測定飲料中山梨酸和苯甲酸的最低濃度為0.002 g／L，比國家規(guī)定飲料中山梨酸和苯甲酸最高含量0.1 g／L低50倍,因此該方法的靈敏度滿足測定要求。

以3倍噪比計(jì)算檢出限，山梨酸和苯甲酸的檢出限分別為 0.0332 μg／mL和 0.00320 μg／mL，明顯低于液–液萃取GC法的檢出限(山梨酸和苯甲酸的檢出限分別為0.813 mg／mL和0.606 mg／mL[5])。

2.3 精密度試驗(yàn)

對市售的幾種飲料樣品進(jìn)行平行測定，測定結(jié)果列于表1。由表1可見，3次平行測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.18%～7.03%。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

對2.3中的飲料樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，兩個添加水平的加標(biāo)平均回收率為80.5%～96.5%。

表2 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語

采用直接固相微萃取法對飲料樣品進(jìn)行處理，然后用氣相色譜法測定飲料中山梨酸和苯甲酸，簡化了樣品處理操作步驟，提高了檢測靈敏度。方法的精密度和準(zhǔn)確度滿足檢測要求。固相微萃取法不需使用毒性大的有機(jī)溶劑，有利于保護(hù)環(huán)境和檢驗(yàn)人員的身體健康。

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