黃芩素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值及其不確定度評(píng)定*

姚換方，全燦，劉軍，侯彩霞

(1.河北聯(lián)合大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，河北唐山 063009； 2.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院化學(xué)計(jì)量與分析科學(xué)研究所，北京 100013)

黃芩素是黃芩的主要活性成分，具有增強(qiáng)免疫、抗炎和抗焦慮等藥理作用，被應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品及食品等領(lǐng)域[1-6],準(zhǔn)確測(cè)定黃芩素的純度對(duì)相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)控具有重要意義。由于黃芩素受光照和pH等條件影響，穩(wěn)定性較差，同時(shí)從中藥材中提取分離純化制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)成本較高[7-8]，當(dāng)前未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外有關(guān)黃芩素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的報(bào)道。

目前黃芩素的主要測(cè)定方法是高效液色譜法[9-10]。筆者通過(guò)高效液相色譜法(HPLC)和定量核磁技術(shù)(QNMR)對(duì)黃芩素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行純度定值。黃芩素的分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

傅里葉變換紅外光譜儀：THRMO NICOLET IS10型，美國(guó)熱電公司；

液相色譜-三級(jí)串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀：6410型，美國(guó)Agilent公司；

圖1 黃芩素的分子結(jié)構(gòu)

高效液相色譜儀：1100型，美國(guó)Agilent公司；

核磁共振儀：AV600型(BBI探頭)，德國(guó)布魯克公司；

卡爾費(fèi)休庫(kù)侖法水分測(cè)定儀：DL-39型，瑞士梅特勒公司；

溴化鉀：光譜純，北京博德恒悅科貿(mào)有限公司；

氘代二甲亞砜：99.9%，美國(guó)Cambridge Laboratoties(CIL)公司；

苯甲酸：99.9%，國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；

色譜純乙腈：99.9%，美國(guó)Fisher Scientific公司；

色譜純甲醇：99.9%，德國(guó)Merck公司；

卡爾費(fèi)休試劑：HYDRANAL?-Coulomat AG-H型，德國(guó)Riedel-deHaen公司；

超純水：電阻率為18.2 MΩ·cm，美國(guó)Milli-Q超純水機(jī)制備。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

黃芩素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原料通過(guò)定性分析確定主體成分，經(jīng)過(guò)初步定量分析篩選使之滿足純度、均勻性初檢要求后，將原料分裝到清洗干燥過(guò)的棕色玻璃瓶中，經(jīng)氮吹后，用真空包裝密封儲(chǔ)存，冷藏于4℃冰箱中。

1.3 定性分析

1.3.1 質(zhì)譜分析

將樣品配成約為10 μg／mL的甲醇溶液進(jìn)行質(zhì)譜分析。采用正離子模式掃描。質(zhì)譜條件：氣體溫度350℃；氣體流速9 L／min；噴霧器壓力275.8 kPa；毛細(xì)管電壓4000 V；質(zhì)量范圍：m／z60～300。

1.3.2 紅外光譜分析

取樣品約1 mg與已干燥的100 mg溴化鉀混合均勻，壓片，進(jìn)行紅外光譜測(cè)量。紅外光譜實(shí)驗(yàn)條件：掃描范圍為400～4000 cm-1；背景掃描(采樣前采集背景)為16；分辨率為4；采樣增益為4。

1.4 純度定值分析

1.4.1 高效液相色譜(HPLC)分析

HPLC 條件：ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(460 mm×250 mm，5μm，美國(guó) Agilent 公司 )；乙腈-0.1%磷酸水溶液(體積比為35∶65)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為 260，265，275，280 nm，定值波長(zhǎng)為275 nm；柱溫為30℃；流速為1 mL／min，樣品濃度為0.5 mg／mL。

1.4.2 定量核磁技術(shù)(QNMR)分析

QNMR條件：探頭溫度為25℃；譜寬為8012.82 Hz；脈沖寬度為4.2 μs，脈沖延遲時(shí)間為32 s；掃描次數(shù)為16次。

1.5 雜質(zhì)分析

雜質(zhì)分析主要包括水分和無(wú)機(jī)元素分析。

水分分析：采用卡爾費(fèi)休庫(kù)侖滴定-直接進(jìn)樣法進(jìn)行水分的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)條件：混合時(shí)間為35 s；攪拌速度：40%。

無(wú)機(jī)元素分析：將樣品配成為0.1 mg/mL的甲醇溶液。利用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)測(cè)定 Li，Be，B，Na，Mg，Al，Si等無(wú)機(jī)元素的含量。

1.6 樣品均勻性檢驗(yàn)和穩(wěn)定性考察

根據(jù)JJF 1006-1994[11]的要求對(duì)黃芩素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了均勻性檢驗(yàn)。從黃芩素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中隨機(jī)抽取15個(gè)包裝進(jìn)行瓶間均勻性檢驗(yàn)；任意選一瓶取7個(gè)子樣，進(jìn)行瓶?jī)?nèi)均勻性檢驗(yàn)。對(duì)HPLC法的測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。

黃芩素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性考察按先密后疏的原則，用HPLC法檢測(cè)在規(guī)定條件下保存的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度隨時(shí)間的變化情況。通常情況下，分別在第1，3，6個(gè)月進(jìn)行穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)。每次取5個(gè)包裝，每個(gè)包裝取一個(gè)子樣，測(cè)3次，計(jì)算平均值，將5個(gè)包裝測(cè)量結(jié)果的平均值作為檢測(cè)結(jié)果。若檢測(cè)結(jié)果的變動(dòng)在定值結(jié)果不確定度范圍內(nèi)，說(shuō)明其穩(wěn)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 定性分析

2.1.1 質(zhì)譜分析

黃芩素的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖分別見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 黃芩素的ESI-MS質(zhì)譜圖

圖3 黃芩素的ESI-MS2質(zhì)譜圖

通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜圖得到準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m／z271約等于黃芩素的相對(duì)分子質(zhì)量(270.24)加上氫的相對(duì)原子質(zhì)量(1.0)。在二級(jí)質(zhì)譜掃描中黃芩素主要發(fā)生兩種裂解方式：一種是[M+H]+通過(guò)C環(huán)中1，2位C—O鍵和3，4位C—C鍵(RDA裂解)發(fā)生斷裂得到碎片離子m／z169，m／z103，A環(huán)再進(jìn)一步失去H2O，CO中性小分子碎片得到碎片離子m／z123，m／z95；另一種[M+H]+通過(guò)A環(huán)上脫去H2O，C2H2O中性分子碎片得到碎片離子m／z253和m／z211。根據(jù)黃酮類化合物的裂解規(guī)律，其中碎片離子m／z169比黃酮[A+H]+的m／z121多48，表明只含有酚羥基，碎片離子m／z103與黃酮[B1+H]+的質(zhì)核比相同，表明B環(huán)中無(wú)取代基。

2.1.2 紅外光譜分析

由紅外光譜圖 4 可知，3410 cm-1(6，7 位，νOH)，3090 cm-1(5 位，νOH)，1660 cm-1(νC=O)，1618，1586和1505 cm-1(黃芩素苯環(huán)骨架的νC=C)與文獻(xiàn)報(bào)道[12]一致。

圖4 黃芩素紅外光譜圖

2.2 純度定值分析

2.2.1 高效液相色譜(HPLC)法分析

在波長(zhǎng)為 260，265，275，280 nm 處進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)黃芩素和雜質(zhì)在275 nm處響應(yīng)值較大，因此定值波長(zhǎng)選為275 nm。黃芩素含有多個(gè)酚羥基，具有弱酸性，容易在溶液中電離，造成峰形拖尾和不尖銳等問(wèn)題，加酸可以抑制其電離，使它呈分子狀態(tài)存在[13-14]，因此本實(shí)驗(yàn)在流動(dòng)相中加入了少量的磷酸。

圖5 黃芩素在275 nm波長(zhǎng)下純度定值HPLC圖

2.2.2 QNMR法分析

通過(guò)脈沖延遲時(shí)間、掃描次數(shù)、脈沖寬度等實(shí)驗(yàn)參數(shù)的優(yōu)化，用QNMR內(nèi)標(biāo)法測(cè)定了黃芩素的純度。實(shí)驗(yàn)中以用于定量的內(nèi)標(biāo)峰(苯甲酸峰)和樣品峰盡可能避開(kāi)干擾為原則，分別把苯甲酸C-2，2'(δ=7.9457，2H)，黃芩素 C-3(δ=6.9287，1H)選為定量峰。

圖6 黃芩素(內(nèi)標(biāo)苯甲酸)的QNMR譜圖

表1 黃芩素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度測(cè)定結(jié)果 %

2.3 雜質(zhì)的分析

水分的測(cè)定結(jié)果為0.538%。

無(wú)機(jī)元素 Li，Be，B，Na，Mg，Al，Si，S，Cl，K，Ca，Sc，Ti，V，Cr，Mn，F(xiàn)e，Co，Ni，Cu ，Zn，Ga，Ge，As，Se，Br，Kr，Rb，Sr，Y，Zr，Nb，Mo，Ru，Rh，Pd，Ag，Cd，In，Sn，Sb，Te，I，Cs，Ba，La，Ce，Pr，Nd，Sm，Eu，Gd，Tb，Dy，Ho，Er，Tm，Yb，Lu，Hf，Ta，W，Re，Os，Ir，Pt，Au，Hg，Tl，Pb，Bi，Th 和 U的含量和為0.0000986%。

2.4 黃芩素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)和穩(wěn)定性考察

按1.6方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)和穩(wěn)定性考察，結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

通過(guò)F和t檢驗(yàn)法對(duì)黃芩素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性進(jìn)行檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)瓶間和瓶?jī)?nèi)均勻性一致。在穩(wěn)定性考察中發(fā)現(xiàn)定值結(jié)果沒(méi)有出現(xiàn)顯著的逐漸增大或減少的趁勢(shì)，證明黃芩素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是穩(wěn)定的。

2.5 不確定度評(píng)定

黃芩素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果的不確定度來(lái)源有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值過(guò)程引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不均勻性引入的不確定度和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不穩(wěn)定性引入的不確定度3部分組成。由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)和穩(wěn)定性考察結(jié)果可知，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性和穩(wěn)定性良好，均符合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的技術(shù)要求，故該部分不確定度可忽略不計(jì)[15-18]。

表2 黃芩素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)結(jié)果 %

表3 黃芩素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果 %

2.5.1 高效液相色譜法的測(cè)量不確定度

(1)高效液相色譜法定值測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度u1由測(cè)量結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算得到，經(jīng)計(jì)算u1=0.01%。

(2)各組分在不同檢測(cè)波長(zhǎng)下響應(yīng)差異引入的不確定度u2

綜合考慮主成分和雜質(zhì)化合物在相應(yīng)檢測(cè)波長(zhǎng)處的響應(yīng)，計(jì)算得u2=0.04%。

合成得高效液相色譜的測(cè)量不確定度：

2.5.2 QNMR法的測(cè)量不確定度

(1)QNMR法定值測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度u3(A類不確定度)，由7次測(cè)量結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算得u3=0.36%。

(2)黃芩素和苯甲酸的相對(duì)分子質(zhì)量的不確定度

從IUPAC的原子量表中查得C，H，O中各元素的原子量和不確定度，經(jīng)計(jì)算得：u(MC15H10O5)＝0.00699 g／moL ；u(MC7H6O2)＝ 0.00326 g／moL。

其不確定度在千位上可以忽略不計(jì)。

(3)苯甲酸內(nèi)標(biāo)引入的不確定度

由國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)苯甲酸的證書(shū)可知其不

2.5.4 擴(kuò)展不確定度

2.6 定值結(jié)果

黃芩素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度：

其中：Pm為水分含量；Pa為無(wú)機(jī)元素含量；PHPLC為HPLC-VWD定值主成分峰的百分比值；PQNMR為QNMR定值主成分的含量。

研制的黃芩素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果為(98.8±0.8)%，k=2。

3 結(jié)論

對(duì)黃芩素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原料經(jīng)過(guò)質(zhì)譜、紅外光譜定性分析后，分別進(jìn)行了水分、無(wú)機(jī)元素含量分析。采用HPLC和QNMR兩種定值方法對(duì)黃芩素原料純度進(jìn)行定值，并對(duì)黃芩素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了均勻性、穩(wěn)定性檢測(cè)和定值不確定度評(píng)定。研制的黃芩素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可應(yīng)用于相關(guān)食品、中藥產(chǎn)品、保健品的質(zhì)量監(jiān)控，為實(shí)現(xiàn)我國(guó)準(zhǔn)確定量檢測(cè)藥品、食品與相關(guān)物質(zhì)提供了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源和物質(zhì)純度標(biāo)準(zhǔn)。確定度為0.1%，按均勻分布考慮，苯甲酸內(nèi)標(biāo)引入的不確定度u4＝0.06%。

(4)天平稱量引入的不確定度

樣品稱量使用分析天平的最小分度為0.1 μg，天平的變動(dòng)性、檢定誤差等估計(jì)為0.5 μg，估算其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u5＝0.01%。

合成得QNMR法的測(cè)量不確定度：

2.5.3 定值結(jié)果的合成不確定度

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