從生豬中分離小腸結(jié)腸炎耶爾森菌病原學(xué)研究＊

穆玉姣，趙嘉詠，郭曉醇，羅 琦，景懷琦，夏勝利

2.登封市防疫站，鄭州 452470；

3.中牟縣防疫站，鄭州 451450；

4.中國(guó)疾控中心傳染病預(yù)防控制所，北京 102206

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Yersiniaenterocolitica）廣泛分布于自然界多種動(dòng)物，家畜家禽帶菌率較高。人類與受感染的家禽家畜接觸，或動(dòng)物糞便污染水源、食品，均可造成散發(fā)感染甚至疫情暴發(fā)。20世紀(jì)80年代曾發(fā)生2次暴發(fā)流行，造成500余人感染［1］。由于該菌嗜冷性的特點(diǎn)，冰箱保存的肉類及肉制品也可能成為傳染源，造成小腸結(jié)腸炎耶爾森菌病的食源性傳播。為了研究本地區(qū)豬咽拭子（扁桃體）攜帶小腸結(jié)腸炎耶爾森菌情況，根據(jù)實(shí)際工作經(jīng)驗(yàn)，春秋兩季在我省登封市生豬屠宰場(chǎng)采集豬咽拭子進(jìn)行該病原菌的分離，并對(duì)分離到的菌株進(jìn)行生化鑒定、生物分型、血清分型和毒力基因的檢測(cè)，分析我省生豬攜帶該菌的病原學(xué)特征，為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌感染性腹瀉病的預(yù)防控制工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 2011年采集河南省登封市生豬屠宰場(chǎng)豬的咽拭子1 346份，屠宰場(chǎng)生豬來(lái)源于登封市周邊農(nóng)戶散養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器 耶爾森菌選擇性培養(yǎng)基及配套抗生素為美國(guó)BD公司產(chǎn)品，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖鹽水 （p H7.4，改良 PBS）、克氏雙糖鐵瓊脂（KIA）、動(dòng)力吲哚尿素培養(yǎng)基（MIU）均購(gòu)自上海CDC，哥倫比亞營(yíng)養(yǎng)瓊脂購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分型血清購(gòu)自日本生研株式會(huì)社（包括O∶1，2；O∶3；O∶5；O∶8；O∶9），菌株鑒定用API20E生化板條及配套試劑均系購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司，PCR擴(kuò)增相關(guān)試劑及引物合成來(lái)自上海生工，PCR熱循環(huán)儀、電泳儀、凝膠成像儀均為美國(guó)Bio－Bad公司產(chǎn)品。

1.3 菌株分離培養(yǎng) 將采集的標(biāo)本接種于10 m L改良PBS中，4℃冷增菌，分別于第7、14、21 d接種耶爾森菌選擇性培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)24～36 h，挑取疑似菌落轉(zhuǎn)種克氏雙糖斜面25℃培養(yǎng)24 h，選擇克氏雙糖＋/＋、不產(chǎn)氣25 H2S－，接種于尿素培養(yǎng)基及半固體培養(yǎng)基，選擇尿素酶＋、25℃培養(yǎng)動(dòng)力＋、37℃培養(yǎng)動(dòng)力－，鏡檢為革蘭陰性桿菌或橢或球桿菌細(xì)菌者，使用API 20E生化板條做系統(tǒng)生化鑒定。

1.4 生物分型 參照文獻(xiàn)［2］的生物分型方法進(jìn)行。

1.5 血清學(xué)分型 生化鑒定為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的菌株進(jìn)行血清學(xué)分型，并設(shè)鹽水對(duì)照。

1.6 DNA模板制備 使用天根細(xì)菌DNA抽提試劑盒提取DNA。具體操作按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.7 毒力相關(guān)基因檢測(cè) PCR［3］檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌粘附侵襲點(diǎn)基因（ail）、耐熱性腸毒素基因（yst A）、生物1A型攜帶的腸毒素基因（yst B）、粘附素（yad A）、yop調(diào)節(jié)子轉(zhuǎn)錄活化作用因子（vir F）。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離（170 V，30 min）。引物序列見(jiàn)表1。

表1 各檢測(cè)基因PCR擴(kuò)增引物序列Tab.1 PCR amplification of primer sequence for Yersinia enterocolitica virulence factors

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)本檢出情況 1 346份生豬咽拭子中共分離出331株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，檢出率為24.59%。

2.2 生物分型及血清學(xué)分型結(jié)果 331株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌經(jīng)API20E生化鑒定板條鑒定與生物分型主要分為3個(gè)生物型：1A型、3型和4型；由于日本生研的血清類型有限，331株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌中只能鑒定出O∶3、O∶5、O∶8這3種血清型（部分菌株與所分型血清均未發(fā)生凝集反應(yīng)，暫定為血清未確定株），其所占比例分別為84.6%（280/331）、2.1%（7/331）、1.8%（38/331）；其中血清型 O∶3均為生物3、4型。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 毒力基因檢測(cè)結(jié)果 對(duì)331株分離的菌株進(jìn)行ail、yst A、yst B、yad A和vir F 5種毒力基因檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。其毒力基因分布特征為：ail＋、yst A＋、yst B－、yad A＋、vir F＋占80.67%（267/331），ail＋、yst A＋、ystB－、yad A－、vir F－占3.32℅（11/331）且均為血清型O∶3；其它型的占16.01%（53/331）。

表2 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌生物分型及血清分型情況Tab.2 Biological typing and serotyping of Yersinia enterocolitica isolates

3 討 論

有研究表明小腸結(jié)腸炎耶爾森菌在豬中尤其是豬咽拭子中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分離率較高［4］，本次試驗(yàn)用無(wú)菌棉簽采集生豬屠宰場(chǎng)豬扁桃體為研究對(duì)象，進(jìn)行病原學(xué)分析。對(duì)1 346份生豬咽拭子分離培養(yǎng)結(jié)果顯示：血清型主要以O(shè)∶3居多，占84.59%（280/331），均為生物3型和4型；未確定血清型的菌株大多為1A型。目前研究認(rèn)為，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌根據(jù)生化反應(yīng)可分為6個(gè)生物型：1A、1B、2、3、4、5型，生物1A 型菌株均屬于非致病型，而生物1B、2、3、4、5型中大多數(shù)為致病性菌株［5］，我們結(jié)果與國(guó)內(nèi)其它報(bào)道基本一致［5－6］。

目前認(rèn)為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的毒力基因主要包括：位于染色體上的毒力基因ail、yst A；位于質(zhì)粒上的基因yad A和vir F，后者是小腸結(jié)腸炎耶爾森菌致病所必須的。ystB編碼一種類似于Yst A的耐熱性腸毒素，它僅存在于生物1A型的菌株中，不具備感染特征。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的致病力主要與分布在染色體和70 kb質(zhì)粒編碼的毒力因子有關(guān)，并且只有在染色體和質(zhì)粒編碼的各種致病因子協(xié)同作用下，才能使菌株突破宿主免疫，造成感染［7］。通過(guò)PCR方法對(duì)所分離菌株進(jìn)行檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)主要血清型 O∶3菌株的毒力基因是ail＋、yst A＋、yst B－、yad A＋、vir F＋，而 ail＋、yst A＋、yst B－、yad A－、vir F－是O∶3血清型毒力菌株丟失質(zhì)粒的結(jié)果。同時(shí)其它基因型，很可能不致病或者致病能力弱。大量實(shí)驗(yàn)證明，致病性耶爾森菌遺傳背景復(fù)雜，染色體DNA指紋分析具有多態(tài)性［8］，因此區(qū)分有無(wú)致病性，不僅需要PCR技術(shù)，而且還需要生化鑒定、血清凝集實(shí)驗(yàn)等輔佐。值得關(guān)注的是，O∶8血清型在國(guó)外的分離株都是致病性菌株〔6〕，而我們分離到的菌株卻都是1A型，且缺乏毒力因子。

生豬咽拭子分離的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌中83.99%（278/331）為致病性菌株，也進(jìn)一步證實(shí)豬是小腸結(jié)腸炎耶爾森菌致病菌株的最主要宿主。我國(guó)的養(yǎng)豬農(nóng)戶比例非常大，并且多是傳統(tǒng)的家庭式圈養(yǎng)，衛(wèi)生條件較差。豬－人傳播在我國(guó)確實(shí)存在很大的可能性，因此，作者認(rèn)為，加強(qiáng)豬中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌產(chǎn)毒菌株攜帶率的監(jiān)測(cè)，將成為預(yù)防和控制本病的關(guān)鍵所在。

表3 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌毒力基因類型PCR檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Virulence gene distribution of Yersinia enterocolitica isolates

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