結核分枝桿菌CFP－10與Rv2626c蛋白的表達及血清學診斷研究＊

朱中元，張 丹，王海波，肖勁逐，邱一帆，顏 磊，陳 德，劉愛國，楊 欣

結核病是當今世界上由單一致病菌感染引起的死亡率最高的疾病，嚴重威脅著人類的健康。全世界大約有三分之一的人感染了結核菌，并且感染人數在以每年700萬～800萬的速度增加。因此，結核病快速準確的早期診斷成為控制結核病流行的重要手段之一。目前我國結核病診斷主要由臨床表現、影像學診斷結合痰涂片鏡檢、細菌培養或PPD皮試進行。但是由于常規細菌學檢查方法的靈敏性差，而且細菌培養費時長（6～8周），以及受人為操作影響等原因，這些方法對于結核病快速的幫助有限［1］。ELISA方法測定結核菌抗體水平具有簡單、低廉、快速的特點，作為結核病的輔助診斷方法之一，正逐漸被眾多研究者所重視。結核菌分泌許多蛋白到細胞外，在結核病人的免疫反應發揮了很重要的作用。研究表明CFP－10是T細胞的靶抗原，能誘導皮膚遲發型超敏反應并刺激外周血單核細胞產生特異性IFN－γ［2］。Rv2626c抗原是 MTB休眠期特異表達的蛋白之一，有較強的抗原性，可激發宿主機體產生較高的抗體水平［3］。本實驗通過構建結核菌CFP－10、Rv2626c蛋白表達載體，在大腸桿菌BL21（DE3）中進行誘導表達，并對表達產物進行純化，以獲得大量CFP－10抗原、Rv2626c抗原，同時將重組的CFP－10、Rv2626c蛋白組成聯合抗原進行ELISA實驗，為探索重組蛋白在結核病血清學診斷的應用奠定前期實驗基礎。

1 材料和方法

1．1 菌種和載體 結核菌H37 Rv、大腸桿菌BL21（DE3）、表達載體p ET－30a均為海南省農墾總醫院保存。

1．2 試劑 β－硫代半乳糖苷（IPTG）、硫酸卡那霉素（Kan）購自上海生工生物工程技術服務有限公司。DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內切酶和DNA Mar ker購自寶生物（大連）有限公司。預染蛋白Mar ker購自北京百泰克生物技術有限公司。普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京天根生物科技有限公 司。6×His－tagged Ni－NTA Agar ose蛋白純化柱是QIAGEN公司產品。常用高純度生化試劑均為Biosharp公司產品，其他試劑均為國產分析純試劑。HRP標記抗人Ig購自Solar bio公司。顯色底物購自英科新創科技有限公司。

1．3 血清來源 118份肺結核患者血清由海口市結核病防治所提供，其中痰涂陽性患者血清20份，痰涂陰性患者血清98份；96份健康查體者血清由海南省農墾總醫院提供。

1．4 引物 根據Gen Bank中結核菌標準株H37 Rv的CFP－10、Rv2626c基因序列，設計 CFP－10基 因5′端 引 物 為 Ⅰ：5′－CCGGAATTCATGGCAGAGATGAAGACCGAT－3′，3′端 引 物 為 Ⅱ：5′－CCCAAGCTTTCAGAAGCCCATTTGCGAGGAC－3′。Ⅰ、Ⅱ的酶切位點分別為Eco RⅠ和Hin dⅢ；Rv2626c基因5′端 引物 Ⅲ：5′－CCGGAATTCATGACCACCGCACGCGACA－3′，3′端引物Ⅳ：5′－CCGCTCGAGCTAGCTGGCGAGGGCCAT－3′。Ⅲ、Ⅳ酶切位點分別為Eco RⅠ和XhoⅠ。引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。

1．5 CFP－10、Rv2626c基因的擴增與克隆 以H37 Rv基因組DNA為模板，PCR擴增CFP－10、Rv2626c基因片段。反應條件：95℃，5 min；95℃，30 s，53 ℃，30 s，72 ℃，1 min，36個循環；72 ℃，7 min；4℃，保存。擴增產物經純化試劑盒處理后，經雙酶切，酶切后擴增產物經切膠回收與同樣方式處理的表達質粒p ET30a在T4 DNA連接酶作用下連接，連接產物轉化入大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，挑選陽性重組子送南京金斯瑞生物工程有限公司測序。

1．6 目的蛋白的誘導表達 將通過測序驗證正確的重組子接種于含50 mg／L卡那霉素的LB液體培養基中，待37℃振蕩培養至吸光度（A600）值為0．6～0．8，加入IPTG至終濃度為1 mmol／L，繼續37℃振蕩培養，從開始誘導表達1 h起每隔1 h留樣待檢，至誘導表達6 h時止，收集菌體，進行SDSPAGE分析。

1．7 重組蛋白表達形式鑒定及純化 收集按最佳誘導表達條件誘導的菌體，冰浴超聲破碎后離心，分別收集沉淀和上清，SDS－PAGE分析目的蛋白的表達形式；采用 QIAGEN 公司6×His－tagged Ni－NTA Agarose蛋白純化柱分離純化帶His標簽的重組蛋白。

1．8 重組CFP－10、Rv2626c蛋白抗原ELISA檢測通過方陣法確定抗原的最適包被濃度和最適第二抗體稀釋倍數。用p H9．6包被緩沖液將重組CFP－10蛋白、Rv2626c蛋白以及2種蛋白的混合物，按2、1、0．5、0．1和0．01μg／孔進行稀釋，每孔100μL加樣，4℃包被過夜；次日將孔內剩余液體甩干，洗滌液洗3次；將小牛血清稀釋10倍，以每孔200μL加樣，37℃下封閉1 h；甩干，洗滌液洗3次；待測血清樣本用PBS進行1∶50稀釋，取100μL加入反應孔，37℃下放置1．5 h，將孔內剩余液體甩干，洗滌液洗3次；將 HRP－二抗按1∶500，1∶1 000和1∶1 500進行稀釋，以每孔100μL加樣，37℃下放置1 h；洗滌液洗3次，每孔加底物液A、B各50μL，避光反應15 min；加入1 mol／L HCl終止反應；酶標儀測定OD450值，結果判定以待測樣本的OD450值于陰性對照的OD450值之比≥2．1為陽性，計算其敏感性與特異性。

2 結 果

2．1 重組CFP－10、Rv2626c質粒的鑒定 從構建陽性重組菌中挑取重組克隆，搖菌后提取質粒經雙酶切鑒定（圖1）。兩者重組質粒酶切片段和PCR擴增片段相同，分別約為303 bp、432 bp。重組質粒測序后，其構建序列與Gen Bank中結核菌H37Rv的基因完全相同。

圖1 重組質粒PET30a－CFP－10、PET30a－Rv2626c的酶切鑒定結果M：DNA marker；1：CFP－10 基 因 PCR 產 物．2－3：PET－30a－CFP－10雙酶切．4：Rv2626c基因 PCR產物，5－6：PET－30a－Rv2626c雙酶切片段。Fig．1 Endonuclease digestion results of expressing plasmid p ET30a－CFP－10 and p ET30a－Rv2626cM：DNA mar ker；1：PCR pr oduct of MTB CFP－10 gene；2－3：Products of Eco RⅠand Hin d Ⅲ digestion of p ET－30a－CFP－10；4：PCR product of MTB Rv2626c gene；5－6：Products of Eco RⅠand Xho I digestion of p ET－30a－Rv2626c

2．2 重組質粒在大腸桿菌中的誘導表達 將篩選到的工程p ET－30a－CFP－10／BL21（DE3）、p ET－30a－Rv2626c／BL21（DE3）經IPTG誘導后，取菌體沉淀進行SDS－PAGE分析（圖2），可見明顯的特異表達產物條帶。重組CFP－10蛋白相對分子質量比預計分子質量大，可能是附加表達了載體上多余的序列；重組Rv2626c蛋白相對分子質量與預計相符，而未誘導的菌體沒有明顯的條帶。

2．3 重組CFP－10、RV2626c蛋白的可溶性分析誘導后的菌體經超聲波破碎，離心，分別取上清和沉淀進行 SDS－PAGE。結果見圖3，重組 CFP－10、Rv2626c蛋白主要存在于上清部分，以可溶性蛋白形式存在。

2．4 重組CFP－10蛋白的純化 收集誘導表達的菌體沉淀，經超聲波破碎，離心，取上清通過鎳瓊脂糖凝膠純化柱分離純化。收集洗脫峰溶液進行SDS－PAGE分析，結果見圖4。

圖2 重組工程菌表達產物的SDS－PAGE電泳圖M：預染蛋白質 Mar ker；1：未誘導的重組CFP－10菌株；2：誘導6 h后的重組CFP－10菌株；3：未誘導的重組Rv2626c菌株；4：誘導6h后的重組Rv2626c菌株。Fig．2 SDS－PAGE results of the p ET－30a－CFP－10／BL21（DE3）and p ET－30a－Rv2626c／BL21（DE3）M：Pre－stained protein MW marker；Lane 1：p ET－30a－CFP－10／BL21（DE3）without IPTG induction；Lane 2：p ET－30a－CFP－10／BL21（DE3）after 6 h of IPTG induction；Lane 3：p ET－30a－Rv2626c／BL21（DE3）wit hout IPTG induction；Lane 4：p ET－30a－Rv2626c／BL21（DE3）after 6 h of IPTG induction．

圖3 重組CFP－10、Rv2626c肽段表達方式分析M：蛋白質分子量標準；1：重組CFP－10蛋白菌體超聲波破碎后的上清；2：重組CFP－10蛋白菌體超聲波破碎后的沉淀；3：重組Rv2626c蛋白菌體超聲波破碎后的上清；4：重組Rv2626c蛋白菌體超聲波破碎后的沉淀。Fig．3 Peptide expression analysis of recombinant CFP－10 and Rv2626cM：pre－stained protein MW mar ker；1：Super natant of CFP－10 expressing E．coli；2：Sedi ments of CFP－10 expressing E．coli；3：Super natant of Rv2626c expressing E．coli；4：Sedi ments of Rv2626c expressing E coli．

圖4 純化重組CFP－10蛋白、重組Rv2626c蛋白SDS－PAGE電泳圖M：蛋白質分子量標準；1：重組CFP－10蛋白菌株誘導產物；2：純化重組CFP－10蛋白；3重組Rv2626c蛋白菌株誘導產物；4：純化重組Rv2626c蛋白。Fig．4 SDS－PAGE electrophoresis figure on r CFP－10 and r Rv2626 proteins before and after purificationM：Pre－stained protein MW mar ker；1：Super natant of CFP－10 expressing E．coli；2：Purified r CFP－10；3：Super natant of Rv2626c expressing E．coli；4：Purified r RV2626c．

2．5 ELISA分析 通過方陣法確定CFP－10肽段最適包被濃度為0．1μg／孔，Rv2626c蛋白抗原為0．1μg／孔，混合抗原最適工作濃度為0．1μg／孔，二者比例為1∶1。酶標二抗最適工作濃度為1∶1 500。然后在該條件下，用重組 CFP－10 蛋白、Rv2626c蛋白及二者組成的聯合抗原對118份確診病人血清和96份健康人血清進行檢測。結果顯示重組CFP－10蛋白抗原檢測結核特異性抗體的總敏感性為75．4%（痰涂陽70．0%／痰涂陰76．5%），檢測健康查體者對照血清特異性為85．4%（82／96）；重組Rv2626c蛋白抗原檢測結核特異性抗體的敏感性為44．1%（痰涂陽45．0%／痰涂陰43．9%），檢測健康查體者對照血清特異性75．0%（72／96）；聯合抗原檢測結核特異性抗體的總敏感性為77．1%（痰涂陽80．0%／痰涂陰76．5%），檢測健康查體者對照血清特異性為82．3%（79／96）。

3 討 論

CFP－10是1998年被鑒定出來的低分子量蛋白，又名mtbll，是一種短期培養濾液蛋白，由l hp基因編碼，屬于ESAT－6家族［4］。CFP－10基因大小為303 bp，編碼100個氨基酸，分子量為10 k Da。只存在于結核分枝桿菌復合群及其它幾種致病性分枝桿菌中，BCG及其它分枝桿菌不表達 CFP－10［5］。因此CFP－10作為抗原可以將結核病與BCG免疫以及非結核菌感染區別開來。Renshaw等研究表明，CFP－10表現出與ESAT－6相當的T細胞性免疫反應，誘導的IFN－γ的釋放水平與ESAT－6相當，具有潛在的診斷應用價值。

Rv2626c抗原是MTB休眠期特異表達的蛋白之一，其功能尚不清楚。Rv2626c基因長432 bp，編碼143個氨基酸，受控于休眠調節子Dos R（dormancy regulon），該基因的表達是MTB進入休眠期的重要標志之一。研究發現Rv2626c基因及其多個下游基因的表達，可使MTB進入休眠狀態，抵御宿主免疫系統的殺傷。Rv2626c抗原可激發宿主機體產生較高的抗體水平，因此，Rv2626c抗原可作為鑒別MTB在宿主機體中的感染狀態的血清學診斷候選抗原。

本實驗采用基因工程的手段來獲得目的基因，構建了CFP－10、Rv2626c蛋白的原核表達載體，并在大腸桿菌中成功表達了重組蛋白，通過對表達產物的純化，獲得了大量CFP－10、Rv2626c抗原，這為探究重組肽段在結核病血清學診斷的應用奠定了前期抗原基礎。

通過酶聯免疫吸附試驗（ELISA）分別檢測重組CFP－10、Rv2626c蛋白與兩者組成的聯合抗原的Ig G抗體，結果顯示聯合抗原檢測結核特異性抗體的敏感性為77．1%，檢測健康對照血清特異性為82．3%。實驗數據顯示，二者聯合檢測的敏感性和特異性較高。應進一步純化這兩種蛋白，優化實驗條件，提高檢測的穩定性。

［1］Karin W，Rosenkrands I，Okkels L M，etal．Assessing the serodiagnostic potential of 35 Mycobacteriu m tuberculosis proteins and identification of f our novel serological antigens［J］．J Clin Micr obiol，2005，43（1）：57－65．DOI：10．1128／JCM．43．1．57－65．2005

［2］Dillon DC，Alderson MR，Day CH，etal．Molecular and i mmunological characterization of Mycobacteriu m tuberculosis CFP－10，an i mmunodiagnostic antigen missing in Mycobacterium bovis BCG［J］．J Clin Microbiol，2000，38（9）：3285－3290．DOI：10．1128／JCM．38．9．3285－3290．2000

［3］Rosenkrands I，Slayden RA，Crawford J，etal．Hypoxic response of Mycobacteriu m tuberculosis studied by metabolic labeling and proteo me analysis of cellular and extracell ular proteins［J］．J Bacteriol，2002，184（13）：3485－3491．DOI：10．1128／JB．184．13．3485－3491．2002

［4］Berthet FX，Ras mussen PB，Rosenkrands I，etal．A Mycobacterium tuberculosis operon encoding ESAT－6 and a novel low－molecular－mass culture filtrate protein （CFP－10）［J］．Micr obiology，1998，144 （11）：3195－3203．DOI：10．1099／00221287－144－11－3195

［5］Lewis KN，Liao R，Guinn K M，etal．Deletion of RD1 from Mycobacteriu m tuberculosis mi mics bacilli Cal mette Guerin attenuation［J］．J Infect Dis，2003，187（1）：117－123．DOI：10．1086／345862