腎細胞癌內皮抑素的表達與微血管密度相關性研究

李旭東 李桂玲 宋貫杰

實體腫瘤的增殖和轉移依賴于新生血管的生成，受血管生成刺激因子和抑制因子的雙重調節。內皮抑素(Endostatin)是一種內源性血管生成抑制因子，能特異抑制血管內皮細胞增殖和血管生成，腫瘤微血管密度(microvessel density，MVD)是衡量血管生成的定量指標，但MVD與RCC預后是否相關，以往文獻報道的結果并不一致［1～3］。本研究檢測RCC組織與癌旁組織Endostatin和MVD，并分析其與RCC病理類型、分級、臨床分期之間的關系，以期為臨床評估RCC提供客觀預后指標，并為RCC的抗血管治療提供研究依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇筆者所在醫院2009年1月～2010年9月手術切除腎細胞癌組織標本且臨床資料齊備者45例。男25例，女20例;年齡35～78歲，平均64.6歲。按WHO分級標準，G1 15例，G2 20 例，G3 10 例。采用 Robson分期［4］，Ⅰ期12例，Ⅱ期14例，Ⅲ期11例，Ⅳ期8例。經病理證實，透明細胞腎癌26例，嫌色細胞腎癌13例，嗜色細胞癌6例。另取腫瘤旁＞2 cm區域的正常腎組織35例作為正常對照組。病例納入標準:(1)手術時未作放療、化療或其他針對腫瘤的生物治療;(2)行根治性手術，術后病理證實為腎細胞癌，組織學分類明確;(3)術后石蠟標本保存完好，有足夠待測組織。

1.2 實驗方法

1.2.1 Endostatin檢測 術后標本分別取腫瘤組織和腫瘤旁正常腎組織，脫水后石蠟包埋，連續切片，采用免疫組化SP法檢測兩組標本中Endostatin。Endostatin蛋白陽性表達為棕黃色顆粒，主要存在于細胞漿(即腫瘤細胞胞漿棕染)。記分標準參照許良中等［5］的方法，隨機選根據細胞漿的著色程度及著色細胞的百分率進行評分。

1.2.2 MVD檢測 采用weidner法［6］，用 CD34抗體標記微血管，計數腫瘤內著色的毛細血管和微小血管。凡呈現棕色單個內皮細胞或內皮細胞簇，均計為1個血管，但肌層較厚及管腔面積＞8個紅細胞直徑的血管不計數。先在低倍鏡下(×100)瀏覽全體，取密度較大的“熱點”處換高倍鏡(×400)計數，取6個不同的視野范圍，取平均值。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件包對數據進行統計學處理。計量資料以(±s)表示，應用t檢驗，計數資料以率或百分比表示，多組均數間的比較應用單因素方差分析和χ2檢驗，相關性用雙變量相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Endostatin的表達情況 Endostatin蛋白在癌旁正常腎臟組織中的表達率為31.4%，在腎癌組織為77.8%，在腎癌組織中的表達強度顯著高于癌旁正常腎臟組織，差異有統計學意義(χ2=16.78，P＜0.01)。見表1。Endostatin蛋白表達在Ⅲ～Ⅳ期中陽性表達率高，與Ⅰ～Ⅱ期比較，差異有統計學意義(P＜0.01)。腎細胞癌患者年齡、性別、腫瘤大小、病理類型及病理分級比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

表1 Endostatin在不同腎臟組織中的表達(n，%)

2.2 MVD的表達情況 腎癌組織中MVD水平明顯高于癌旁正常腎臟組織，兩者比較差異有統計學意義(t=7.291，P＜0.01)。見表3。臨床分期Ⅲ～Ⅳ期MVD顯著高于Ⅰ～Ⅱ期(P＜0.01)，臨床分期越早，MVD越低，臨床分期越晚，MVD越高;MVD在組織學G1、G2、G3級之間差異有統計學意義(P＜0.05)，組織學分級低，腫瘤分化好，MVD越低;組織分級升高，分化差，MVD升高。腎細胞癌患者年齡、性別、腫瘤大小比較差異無統計學意義。見表4。

2.3 Endostatin與MVD在腎癌組織中表達的相關性 Endostatin MVD在腎癌組織中表達的相互關系顯示，Endostatin與MVD的表達具有相關性(P＜0.05)。見表5。

表3 MVD在不同腎臟組織中的表達

3 討論

腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)為富含血管的實體性腫瘤，腫瘤血管生成是血管形成促進因素和抑制因素之間失衡的結果，同時腫瘤血管生成也受進入循環系統的腫瘤細胞與腫瘤微環境的影響［7］。新生血管不僅可促進腫瘤的生長，還能為腫瘤提供足夠的轉移路徑。一方面這些新生血管不成熟，結構缺乏完整性，管壁薄弱，比正常血管更容易被腫瘤細胞穿透，使瘤細胞易穿透血管順血流到遠隔部位形成微小轉移灶［8］;另一方面腫瘤組織內基質不完善，使瘤細胞產生的各種因子和蛋白酶類滲漏至細胞間隙，進而誘發更多的血管生成。MVD作為惡性腫瘤的診斷、預后評估和分層治療的客觀指標而被廣泛使用。本研究結果顯示，RCC組織中MVD明顯升高，且與病理分級和臨床分期相關。表明新生的微血管使瘤體血供增加，即微血管為腫瘤的快速增長及代謝提供了物質基礎。

Endostatin基因定位于Collagen XⅧ基因第38～43號外顯子和部分37號外顯子編碼的C末端NC1結構域內［9］，在體內由膠原XⅧ降解產生，能通過多種途徑抑制腫瘤血管的生成，阻斷腫瘤的血液供應。國內外大量的文獻報道表明，Endostatin能夠有效控制非小細胞性肺癌、消化道腫瘤、腦膠質瘤等各類腫瘤的生長、浸潤和轉移［10～13］。本研究提示Endostatin蛋白在RCC組織中的表達水平顯著高于癌旁正常腎臟組織，Endostatin的表達強度在不同臨床分期的病例中，差異顯著。Endostatin在正常組織中有一定表達，提示Endostatin參與了正常情況下血管形成的生理調節過程。本研究結果顯示，RCC組織中MVD與內皮抑素呈高度相關，即隨著MVD增加，Endostatin表達增強。這可能是由于RCC細胞為了滿足其生長和浸潤的需要產生了大量促血管生成因子，機體內的調節系統同時也會產生大量的Endostatin來抗衡機體內高水平的血管生成因子，這是機體的自身調節機制，但是這種代償作用仍不能達到正常的平衡狀態，最終因為調節失衡導致新生血管生成增多，促進了腫瘤的侵襲和轉移。因此，測定 Endostatin、MVD可評估 RCC惡性程度、轉移及預后。

表4 MVD在腎癌組織中表達與腎癌臨床病理參數間的關系

表5 Endostatin與MVD在腎癌中表達的相互關系

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