產ESBLs革蘭陰性桿菌中16SrRNA甲基化酶基因的檢測

高 輝，王 楊，黃云昆，朱雯梅，徐 敏

（昆明市延安醫院 檢驗科，云南 昆明 650051）

產ESBLs革蘭陰性桿菌中16SrRNA甲基化酶基因的檢測

高 輝，王 楊，黃云昆，朱雯梅，徐 敏

（昆明市延安醫院 檢驗科，云南 昆明 650051）

產 超 廣 譜 β－內 酰 胺 酶 （extended-spectrumβlactamases，ESBLs）的革蘭陰性桿菌是醫院感染的重要病原菌，表現為多重耐藥，給臨床抗感染治療帶來了極大的困擾。近年來研究發現，一類由質粒介導的16SrRNA甲基化酶可使細菌的30S核糖體16SrRNA不與氨基糖苷類藥物結合，從而導致細菌對氨基糖苷類藥物出現高水平耐藥，有研究顯示16SrRNA甲基化酶基因常與ESBLs基因位于同一質粒上，可在不同菌種間水平傳播或同種間克隆傳播從而造成多重耐藥性的傳播。本研究對臨床標本中分離的56株產ESBLs革蘭陰性腸桿菌進行了16SrRNA甲基化酶基因篩查，以了解其流行情況，為進一步研究昆明地區該耐藥基因的分布情況奠定基礎，為提高臨床抗感染治療效果提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

2010年1月－2010年10月昆明市延安醫院（三甲綜合醫院）臨床標本中分離的ESBLs陽性非重復性革蘭陰性腸桿菌56株，包括大腸埃希式菌、肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌、奇異變形桿菌。藥敏質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，ESBLs表型確認試驗質控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC700603。

1.2 藥敏紙片和培養基

藥敏紙片中亞胺培南、美洛培南、環丙沙星、為英國Oxoid公司產品，其余藥敏紙片為北京天壇藥物生物技術開發公司產品。藥敏試驗用M-H培養基，為英國Oxoid公司產品。

1.3 細菌鑒定與藥敏試驗

用法國生物梅里埃VITEK32細菌鑒定儀進行細菌鑒定，藥敏試驗采用K-B瓊脂擴散法，按美國臨床實驗室標準化協會（CLSI2009）的標準判讀藥敏試驗結果。

1.4 ESBLs檢測

采用CLSI推薦的雙紙片擴散法，使用CTX和CTX／CA、CAZ和CAZ／CA兩對紙片進行ESBLs表型確認試驗，嚴格按照CLSI推薦的操作和結果判斷標準進行，以肺炎克雷伯菌ATCC700603為ESBLs陽性對照。

1.5 提取細菌基因組DNA

用細菌基因組提取試劑盒提取細菌DNA，按試劑盒說明書操作，試劑盒由天根生物技術有限公司生產。

1.6 基因檢測

用Biometra Personal Cycler PCR儀擴增6種16SrRNA甲基化酶基因和TEM型β－內酰胺酶基因，Taq PCR MasterMix購自北京博邁德科技發展有限公司，PCR擴增引物由北京百泰克生物技術有限公司合成，靶基因引物序列見表1［1］。TEM基因PCR擴增體系為：2×Taq Master Mix 25μl，模板0.5μl，P1引物2μl，P2引物2μl，無菌去離子水補足至50μl。熱循環參數為：94℃2min，然后94℃60s→55℃60s→72℃60s，循環35個周期，最后72℃10min。6種16SrRNA甲基化酶基因PCR擴增體系均為：2×Taq Master Mix 25μl，模板0.5 μl，P1引物2μl，P2引物2μl，無菌去離子水補足至50μl。熱循環參數均為：95℃預變性3min，然后95℃60s→55℃60s→72℃60S。循環30次，72℃延伸10min。產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，Bio-Rad Laboratories 6000凝膠成像系統觀察結果，并攝像保存。出現與陽性對照分子相當的目的條帶為陽性，armA基因陽性對照DNA由浙江大學醫學院俞云松教授惠贈。

2 結果

2.1 β－內酰胺酶基因PCR檢測結果

56株表型確認產ESBLs革蘭陰性腸桿菌科細菌均檢測出TEM基因，其PCR產物電泳結果見圖1。

2.2 16SrRNA甲基化酶基因PCR檢測結果

56株產ESBLs革蘭陰性腸桿菌科細菌進行armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA 基因擴增均為陰性，其PCR產物電泳結果見圖2。

表1 PCR引物序列

圖1 TEM基因擴增產物電泳圖

圖2 16SrRNA甲基化酶基因擴增產物電泳圖

3 討論

文獻報道，昆明地區產ESBLs的耐藥菌株有較高的檢出率［2］。本研究通過表型確證試驗確證的56株產ESBLs革蘭陰性桿菌均檢測出TEM型β－內酰胺酶基因。目前已發現了160種TEM型衍生酶，其中大部分是 ESBLs［3－5］。本研究中的產 ESBLs菌株具體為何種TEM亞型尚待測序分析。

產ESBLs的菌株表現為多重耐藥，常常對臨床所用的氨基糖苷類藥物同時耐藥。普遍認為細菌對氨基糖苷類藥物耐藥的主要機制是細菌產生了可以水解氨基糖苷類藥物的酶，但這些水解酶不能水解所有的氨基糖苷類藥物，如阿貝卡星。近年研究發現，一類由質粒介導的16SrRNA甲基化酶能使藥物作用靶位16SrRNA G1405上的N-7位鳥苷變為7－甲基鳥苷或將A1408上的腺嘌呤N-1位甲基化，致使細菌的30S核糖體16SrRNA與氨基糖苷類藥物的親和力下降，從而出現對氨基糖苷類藥物的高水平耐藥，其 MIC值往往高達512－1024μg／ml［6－10］，因此，產16SrRNA 甲基化酶可使細菌泛氨基糖苷類耐藥。有研究發現16SrRNA甲基化酶基因與β－內酰胺酶基因存在連鎖關系，常與碳青霉烯酶或者ESBLs編碼基因連鎖傳播［11］，通過質粒介導，以轉化、轉導、結合、傳遞等方式在同種或不同種屬菌株間轉移和傳播，造成院內感染流行，對氨基糖苷類和β－內酰胺類抗菌藥物的臨床應用產生嚴重的影響。

到目前為止，在革蘭陰性桿菌中已發現armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和npmA 6種16SrRNA甲基化酶基因。在一些歐美國家都有質粒介導16S rRNA甲基化酶臨床分離株引起感染的報道［6，8，12－14］。研 究 表 明，北 美 洲 主 要 以 armA 和rmtB為主，歐洲以armA為主，拉丁美洲以rmtD為主［14］，不同地區16SrRNA甲基化酶的流行率和流行基因型存在差別。2004年中國臺灣地區分離的肺炎克雷伯菌armA和rmtB的陽性率分別為0.4%和0.04%［8］。國內不同地區醫院16SrRNA甲基化酶基因檢出率也各有不同，杭州沈曉強等報道在6省市臨床分離的447株產ESBLs的菌株中篩選到1株產armA型16SrRNA甲基化酶的產酸克雷伯菌，吳蓉等報道在上海普陀醫院臨床分離的53株對慶大霉素和／或阿米卡星耐藥的革蘭陰性桿菌中篩選出10株產16SrRNA甲基化酶的菌株［1，11］。

本院近年來革蘭陰性桿菌對慶大霉素的耐藥率持續在50%－60%，對阿米卡星的耐藥率則維持在8%－10%，監測我院16SrRNA甲基化酶基因的攜帶情況對臨床有重要意義。本研究結果顯示56株產ESBLs革蘭陰性腸桿菌均未檢出16SrRNA甲基化酶基因，與國內其他地區的檢測結果存在差別［1，11］，導致菌株耐藥基因攜帶率不同的原因可能與菌株來源（地理位置）和各地區醫院抗菌藥物的使用習慣不同有關，也與本研究的樣本僅限于產ESBLs革蘭陰性腸桿菌科細菌有關。雖然如此，仍應重視對該耐藥基因的早期篩查和監控，本課題組也將擴大樣本范圍及樣本量繼續追蹤調查本地區耐藥基因的流行情況。

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1007－4287（2012）10－1910－03

2011－03－07）