銅綠假單胞菌與水解酶的關系

王 煒，陳曉萌，金 曄

（首都醫科大學附屬北京友誼醫院 檢驗科，北京100050）

銅綠假單胞菌是假單胞菌屬中的代表菌種。最早是在1882年從病人化膿的傷口中分離出來，因產綠色色素，故俗稱綠膿桿菌。銅綠假單胞菌是革蘭染色陰性細菌，有鞭毛和莢膜，致病菌株有菌毛，一般不形成芽胞，常常感染免疫力低下的病人，引起菌血癥、敗血癥、傷口感染、泌尿系統感染和囊性纖維化等疾病。

銅綠假單胞菌是醫院感染重要的條件致病菌，在醫院感染中占有非常重要的地位。在美國，銅綠假單胞菌感染占醫院感染的10%，是肺囊性纖維化病人合并肺部感染的首要病原，是導致醫院獲得性肺炎的第2位病原，約17%的醫院獲得性肺炎為該細菌導致，同時該菌可引起11%左右的尿路感染，8%的手術部位感染，3%的血液感染［1］。本文探討水解酶的產生是否銅綠假單胞菌對多種抗生素產生耐藥表現的主要機制。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2010年5月－2011年5月，首都醫科大學附屬北京友誼醫院臨床檢驗中心細菌室分離的來自不同患者的銅綠假單胞菌159株。經VITEK2全自動微生物分析儀（法國生物梅里埃公司）鑒定為銅綠假單胞菌。

質量控制菌株：大腸埃希菌ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC27853。為我實驗室保存菌株。

1.2 受試藥物

見表1。

表1 抗菌藥物來源、批號和效價

濃度梯度按照CLSI 2010版對敏感、中介、耐藥的解釋標準自行設計。

1.3 儀器及試劑

培養基：血瓊脂平板培養基作為分離培養基（天津金章公司）

Mueller－Hinton（M－H）瓊脂為紙片擴散法聯合藥敏試驗用培養基（MH培養基干粉為英國Oxoid公司產品）

藥敏板：96孔藥敏板購自天津金章公司

生物安全柜（Thermo Scientifc 1300，美國）

電熱恒溫培養箱（DNP－9162，上海）

比濁儀（生物梅里埃Vitek，法國）

微量移液器（eppendorf，德國）

1.4 方法

1.4.1 抗菌藥物敏感性試驗 采用微量肉湯稀釋法測定以下抗菌藥物對試驗菌株的最低抑菌濃度MIC，抗菌藥物包括亞胺培南、美羅培南、頭孢他啶、頭孢吡肟、舒巴坦／頭孢哌酮、環丙沙星、左氧氟沙星、妥布霉素、阿米卡星、氨曲南、他唑巴坦／哌拉西林、多粘菌素B。各藥物濃度為試驗者自行設計、配制。所有MIC數據參照CLSI（Clinical And Laboratory Standards Institute，美國臨床實驗室標準化委員會）2010版M100－S20文件解釋。

1.4.2 三維水解試驗檢測β－內酰胺酶 ①試劑的配制：克拉維酸溶液2 mmol／L，鄰氯西林溶液2 mmol／L，EDTA－Na2溶液（100 mmol／L）。②粗提酶的制備：將新分離的待檢菌密涂于1／4 MH瓊脂平板（Φ＝90 mm）上，35℃培養24 h后，用滅菌棉棒取下全部菌苔于1 ml滅菌生理鹽水中（用1.5 ml離心管）。將離心管置－70℃低溫冰箱凍融5次（凍2 h以上，再取出融化），在4℃條件下13 000 r／min離心1 h，抽取上清液，用0.2μm過濾器過濾，取1滴粗提酶液接種于 MH瓊脂平板上，35℃培養24 h后，以無菌生長為合格的粗提酶液。③酶型檢測：將0.5麥氏單位的標準大腸桿菌ATCC25922菌液涂抹于MH瓊脂平板上，10 min后于平板中央貼一片30μg IPM紙片，距紙片邊緣5 mm處垂直打4個1 mm寬10 mm長的槽，分別于槽內加40μl粗提酶液、粗提酶液（36μl）＋CLO（4μl）、粗提酶液（36μl）＋CLA（4μl）及粗提酶液（36μl）＋CLO（4μl）＋CLA（4μl）把含10μg／片亞胺培南（IPM）貼于 MH平板，分別在距亞胺培南紙片邊緣5 mm處，挖2個1×10 mm的槽，分別于槽內加40μl粗提酶液、粗提酶液（36μl）＋EDTA－Na2（4μl），置35℃培養24 h。④酶型判斷：當抑菌環出現缺損，形成一指向藥敏紙片的矢狀菌苔，即酶水解實驗呈陰性。加入酶抑制劑時，CLA單獨加入時抑酶試驗為陽性，即該菌ESBL檢測陽性。CLO單獨加入時抑酶試驗為陽性，即該菌AmpC酶檢測陽性。CLO或CLA單獨加入不能抑制酶活性（抑酶試驗陰性），同時加入CLO和CLA時抑酶試驗為陽性，說明該菌同時產生Amp C和ESBLs兩種酶。當同時加入CLO和CLA時抑酶試驗仍為陰性，該菌可能產生耐抑制劑廣譜酶；若EDTA單獨加入時抑酶試驗陽性，即該菌金屬β內酰胺酶（MBL）陽性。見圖1。

2 結果

圖1 三維水解試驗檢測β－內酰胺酶陰性

表2 159株碳青霉烯耐藥的銅綠假單胞菌對抗菌藥物的藥敏結果

159株臨床分離的非重復銅綠假單胞菌，單藥MIC顯示試驗中銅綠假單胞菌對于CLSI2010推薦和臨床常用抗菌藥物（碳青霉烯類、頭孢菌素類、β－內酰胺類／β－內酰胺酶抑制劑類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類）敏感率低，呈現多重耐藥表型，見表2。多重耐藥銅綠假單胞菌（multidrug resistant Pseudomonas aeruginosa MRPA）的納入標準為：抗菌藥物耐藥種類大于5類（碳青霉烯類、頭孢菌素類、β－內酰胺類／β－內酰胺酶抑制劑類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類）；尤其是對于頭孢哌酮／舒巴坦、哌拉西林／他唑巴坦耐藥性為100%，對于頭孢吡肟、氟喹諾酮類、氨基糖苷類大約半數細菌呈現耐藥，對于多粘菌素B細菌全部呈現敏感。推測出現上述現象的原因是臨床對于β－內酰胺／β－內酰胺酶抑制劑的使用偏好，經驗用藥使用此類藥物比例較大，容易出現耐藥情況。多粘菌素主要作用于細菌細胞膜，使細胞內的重要物質外漏，為慢效殺菌劑。很少通過消化道吸收，主要通過腎臟排出，故腎功能不全者應減少劑量。多粘菌素類不良反應明顯，主要為腎毒性和神經毒性，但多粘菌素的抗菌作用強、不易產生耐藥性，故當各種革蘭陰性桿菌對其他抗菌藥物耐藥或療效不佳時，仍可作為選用藥物。臨床可供選用的是多粘菌素B和多粘菌素E。多粘菌素E在腎、肝、肺等組織中濃度比多粘菌素B高，但不易通過無炎癥的血腦屏障［2－4］。

表3 159株銅綠假單胞菌對7類抗生素的耐藥情況

水解酶驗證：通過三維實驗159株Pa中檢測出產MBL15株，Amp C酶13株；說明水解酶的產生不是本院多重耐藥銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因。

3 討論

銅綠假單胞菌主要是在抗菌藥物的選擇壓力下耐藥率不斷上升，其耐藥機制比較復雜：可通過產生金屬β－內酰胺酶水解碳青霉烯類抗菌藥物；可通過Opr D2蛋白特異性通道表達減少或缺失減少亞胺培南的進入；通過群體性生物被膜的形成減少抗菌藥物的攝入；對已經進入的抗菌藥物還可通過主動外排系統泵出。但對不同碳青霉烯耐藥機制有所差異，亞胺培南耐藥主要涉及外膜蛋白缺失；美羅培南耐藥則需細菌主動外排表達增加；金屬酶及生物被膜的產生可能導致細菌對所有碳青霉烯類耐藥。銅綠假單胞菌的耐藥機制極為復雜，這四種機制可單獨發揮作用，也可聯合發揮作用，但是也有研究證明外排泵在生物被膜耐藥中無作用［5－7］，現在還不斷有新的耐藥機制被發現。本試驗只在細菌的表型方面檢測了159株銅綠假單胞菌是否產生金屬酶或者頭孢菌素酶，未進一步檢測其它水解酶，下一步實驗要進一步完善。對于以上的耐藥機制我們還應進行更深入的研究，指導臨床合理用藥，并積極開發新的抗菌藥物來針對這些耐藥機制。同時因為這些耐藥機制都是在抗菌藥物（尤其是第三代頭孢菌素）的選擇壓力下產生或加強的，我們要倡導合理、適量、分階梯的使用抗菌藥物，并對當地重要藥物進行周期性耐藥監測，提倡個性化選擇藥物，針對不同的臨床藥敏試驗結果選用不同的抗菌藥物，尤其是在治療過程中耐藥性的演變。減緩銅綠假單胞菌耐藥的產生和發展，最大限度的減少多重耐藥的銅綠假單胞菌出現，從而保障人民群眾的生命健康。

［1］Paterson DL.The epidemiological Profile of infections with multidrug resistant pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter species［J］.Clin Infect Dis，2006，43（suppl－2）：S43.

［2］郭晨雯，范 春，牛其昌.1999－2003年銅綠假單胞菌耐藥性變遷的分析［J］.中華醫院感染學雜志，2005，15（8）：940.

［3］陳 瑞，唐英春，朱家馨.耐亞胺培南銅綠假單胞菌的耐藥性和金屬酶研究［J］.中國微生態雜志.2006，18，（6）：209.

［4］Valerie Aloush，Shiri Navon－Venezia，Yardena Seigman－Igra.Multidrug－Resistant Pseudomonas aeruginosa：Risk Factors and Clinical Impact［J］.Antimicrob Agents Chemother，2006，50（1）：43.

［5］Oana Ciofu，Bente Riis，Tacjana Pressler.Occurrence of Hypermutable Pseudomonas aeruginosa in Cystic Fibrosis Patients Is Associated with the Oxidative Stress Caused by Chronic Lung Inflammation［J］.Antimicrob Agents Chemother，2005，49（6）：2276.

［6］De Kievit TR，Parkinsy D，Gillis RJ.Multidrug efflux pumps：expression patterns and contribution to antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms［J］.Anti－microb Agents Chemother，2001，45（6）：1761.

［7］王繼東，周麗珍，宮玲玲.銅綠假單胞菌的多重耐藥基因研究［J］.中華醫院感染學雜志，2006，16，（3）：241.