IPaH－1基因在志賀氏菌表達的檢測及PCR條件的優化

羅雁非，丁 旭，文 雪，張曉靜，李洪軍，何成彥，趙麗純＊

（1.吉林出入境檢驗檢疫局，吉林 長春130021；2.吉林大學藥學院，吉林 長春130021：3.吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033）

志賀氏菌（Shigella）又稱痢疾桿菌，是一類以引起腹瀉癥狀為主的常見致病菌，據 WHO報道，世界上每年有1.65億感染志賀氏菌，年死亡人數達110萬，99%發病人數在發展中國家，尤其是衛生條件差的地區，以5歲以下的兒童為主［1］。多種致病菌導致的腸道傳染病嚴重威脅著人類健康。致病菌的實驗室金標準鑒定手段仍然是培養、血清學和生化等傳統的細菌學檢測方法，步驟相對繁瑣，一般需要數天才能得到結果，給檢驗帶來不便。因此建立快速、準確、靈敏的致病菌檢測方法對此類傳染病的早期判定至關重要。近年來，PCR和核酸雜交技術的應用，促進了細菌檢測技術的發展［2］。侵襲性質粒抗原H基因（invasion plasmid antigen H，ipaH，IPaH）是同時存在于痢疾桿菌染色體和侵襲性大質粒上的侵襲基因。通過分子生物學方法檢測IPaH基因，可以快速檢測腹瀉患者糞中的痢疾桿菌，且在發病率評估上比細菌培養法靈敏準確［3－5］。但目前未見通過PCR法全面系統檢測IPaH1基因在鮑氏志賀氏菌、野生志賀氏菌、大腸埃希氏菌、出血性大腸埃希氏菌（O157：H7）、腸炎沙門氏菌、阪崎腸桿菌、普通變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、單增生李斯特菌、副溶血性弧菌、產氣莢膜梭菌等常見致病菌中的表達的報道。因此本研究檢測了IPaH1基因在志賀氏菌等幾種常見腸道致病菌中的表達，以確定IPaH1基因在志賀氏菌表達的特異性，為進一步進行ipaH1基因液態芯片的研究奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種及來源

實驗所用標準菌株及其來源見表1。

表1 菌種及來源

標準株均采購于北京中原公司，分離株來自吉林出入境檢驗檢疫局微生物實驗室。

1.2 主要試劑和儀器

LB培養基、胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯培養基（TSB－YE）、氯化鈉蔗糖培養基、氯化鈉結晶紫增菌液、亞硫酸鹽－多粘菌素－磺胺嘧啶瓊脂（SPS）（液體硫乙醇酸鈉等購自北京陸橋技術有限責任公司、Wizard○RGenomic DNA Purification Kit 試 劑 盒（Promega）、2×Easy Taq PCR SuperMix、瓊脂糖、100bp DNA Ladder Marker（大連寶生物）、DL2000 DNA Ladd er Marker（大連寶生物）等。

恒溫培養箱（德國Binder）、水浴箱（美國Shellab）、PCR儀（美國 ABI）、電泳儀（PS500A）、Alphalmager EC紫外凝膠成像分析系統（美國Alpha）等。

1.3 引物

根據GenBank上IPaH－1基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設計2對引物，以16srRNA作為內參基因。由上海捷瑞生物工程公司合成，序列如表2。

表2 引物序列

1.4 菌株的培養

鮑氏志賀氏菌、野生志賀氏菌、大腸埃希氏菌、出血性大腸埃希氏菌（O157：H7）、腸炎沙門氏菌、阪崎腸桿菌、普通變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌用LA平板，糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、單增生李斯特菌用TSA平板，37℃溫箱過夜培養，然后挑取單菌落接種到相應的液體培養基，37℃水浴振蕩培養過夜；副溶血性弧菌用氯化鈉蔗糖平板37℃溫箱過夜培養后挑取單菌落接種到氯化鈉結晶紫增菌液，37℃水浴振蕩培養過夜；產氣莢膜梭菌用SPS平板37℃厭氧培養24－48h，然后挑取黑色單菌落于液體硫乙醇酸鈉中37℃過夜培養。

1.5 細菌基因組DNA的提取

按照 Promega Wizard？Genomic DNA Purification Kit試劑盒使用說明操作，簡述如下：取1ml過夜培養物至1.5ml離心管中；13，000r／mim 離心2min收集菌體；加入600μl核裂解液重懸菌體；80℃ 孵育5min裂解細胞，冷卻至室溫；加入3μl RNA酶溶液，顛倒5次；37℃孵育35min，冷卻至室溫；加入200μl蛋白沉淀液，劇烈振蕩20s，冰上孵育5min；13，000r／mim離心3min；移上清至一離心管中，加入600μl異丙醇；輕輕顛倒混勻；13，000 r／mim離心2min；棄上清；加入600μl 70%乙醇，輕柔顛倒離心管數次；13，000r／mim 離心2min。小心吸去乙醇，將離心管倒置在干凈的吸水紙上，自然干燥15min；加入100μl DNA溶解液，4℃ 孵育過夜后，－20℃保存備用。

1.6 PCR擴增目的基因

PCR反應體系（25μl）：2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5μl；上、下游引物（10μM）各0.5μl；基因組DNA 模板1ng／μl 1μl；無菌水定容至25μl。循環參數：95℃ 2min；94℃ 45sec、52℃ 30sec、72℃30sec，30個循環；72℃ 延伸5min。

1.7 PCR反應條件優化

1.7.1 退火溫度優化：PCR體系中各成分濃度不變，反應程序，退火溫度依次為49.0℃，50.0℃，51.0℃，52.0℃，53.0℃，54.0℃，55.0℃，56.0℃，57.0℃，58.0℃，59.0℃。

1.7.2 引物濃度優化：PCR反應體系為25μL，反應程序不變，其他成分濃度不變，引物終濃度依次為0.02μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM。

2 實驗結果

2.1 IPaH1在幾種腸道致病菌的表達

以鮑氏志賀氏菌、野生志賀氏菌、大腸埃希菌、出血性大腸埃希氏菌（O157：H7）、腸炎沙門氏菌、阪崎腸桿菌、普通變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、產氣莢膜梭菌等基因組DNA為模板進行PCR，結果可見IPaH1－1、IPaH1－2兩對引物均在志賀氏菌擴增出較高表達水平的目的條帶，片段長度與預期一致，其他11種菌均為陰性，見圖1A、B。

A：引物為IPaH1－1；B：引物為IPaH1－2；M：DL 2000Marker；1－14的模板依次為：志賀氏菌ATCC 9207，志賀氏菌JL 08036，大腸埃希菌，出血性大腸埃希氏菌（O157：H7），腸炎沙門氏菌，阪崎腸桿菌，普通變形桿菌，蠟樣芽孢桿菌，糞腸球菌，金黃色葡萄球菌，單核細胞增生李斯特菌，副溶血性弧菌，產氣莢膜梭菌，空白對照

2.2 PCR反應條件優化

以鮑氏志賀氏菌基因組DNA為模板，對退火溫度、引物濃度及模板濃度等PCR反應條件進行了優化。

2.2.1 退火溫度的優化

結果顯示，引物IPaH1－1在55.0℃－59.0℃退火溫度下，擴增產物條帶均很清晰，表明該反應體系的最佳退火溫度在55.0℃－59.0℃之間；引物IPaH1－2在51.0℃－55.0℃條帶均很清晰，說明該反應體系的最佳退火溫度在51.0℃－55.0℃之間；如圖2、3所示。以下實驗反應中以56℃為引物IPaH1－1的退火溫度，以52℃為引物IPaH1－2的退火溫度。

圖2 退火溫度對IPaH1基因擴增的影響引物（引物為IPaH1－1）

圖3 退火溫度對IPaH1基因擴增的影響引物（引物為IPaH1－2）

2.2.2 引物濃度的優化

結果顯示，引物IPaH1－1、IPaH1－2終濃度為0.1μM時擴增條帶已經很清晰，圖4。

圖4 引物濃度對IPaH1基因擴增的影響

3 討論

志賀氏菌引起腸道傳染病發病率位居法定傳染病之首，嚴重危害人們的身體健康，因此建立比傳統檢測方法更快速、準確、實用的檢測方法尤為重要［6］。近年來，建立了一些新的檢測方法，如PCR檢測技術和基因芯片技術等分子生物學檢測技術。這些檢測技術在很大程度上依賴于PCR擴增，特別是多重PCR，對于引物的要求更高。我們設計引物時，根據志賀氏菌毒力基因表達產物侵襲性質粒抗原 H基因（ipaH）、侵襲相關基因（ial）、志賀菌腸毒素1基因（ShET－1）和志賀菌腸毒素2基因（ShET－2）［7，8］。但志賀氏菌同許多病原菌一樣都存在毒力相關基因也稱毒力島［9］，這對志賀氏菌特異性引物的設計增加了難度。

1987年Buysse等［10］發現IPaH以多拷貝同時存在于各型志賀氏菌染色體和侵襲性大質粒上，不隨傳代而丟失。以IPaH設計引物建立PCR檢測方法具有較高敏感性并可避免因基因突變、質粒丟失而導致的假陰性。已有研究以IPaH基因擴增為基礎進行了IPaH4.5的功能研究［11］。本文根據引物設計原則和相關信息設計了包括管家基因在內的七對引物（未全部列出），從中篩選出符合分子生物學檢測志賀氏菌IPaH1基因表達，具較高特異性的兩對引物，在大腸埃希氏菌、出血性大腸埃希氏菌（O157：H7）、腸炎沙門氏菌、阪崎腸桿菌、普通變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、單增生李斯特菌、副溶血性弧菌、產氣莢膜梭菌未見表達；并從退火溫度、引物濃度方面對PCR反應條件進行了優化，兩對引物理想終濃度均為0.1μM，最適退火溫度分別為55.0℃－59.0℃、51.0℃－55.0℃。本研究結果為進一步建立IPaH1基因液態芯片檢測系統奠定了實驗基礎。

［1］Golovliov I，Sjstedt A，Mokrievich A，Pavlov V.A method for allelic replacement in Francisella tularensis ［J］.FEMS Microbiol Lett，2003，222（2）：273.

［2］邵 暉，吳玲玲，王 偉，等.食品中病原微生物檢測方法進展及優缺點評價［J］.中國食品工業，2008，23（4）：40.

［3］李小麗，陰赪宏，溫 艷，等.PCR快速檢測腹瀉患者糞中痢疾桿菌致病基因ipaH和iaI［J］.世界華人消化雜志，2007，15（19）：2128.

［4］李智瓊，鄧尚廉，孫承謀.用檢測ipaH基因的PCR檢測志賀菌屬［J］.臨床檢驗雜志，2009，27（3）：185.

［5］王松梅，郝志勇，馬景臣，等.PCR檢測與細菌培養方法在細菌性痢疾監測中的應用比較［J］.復旦學報（醫學版），2006，33（6）：766.

［6］趙麗華，周 勇，萬成松.分子信標PCR檢測志賀菌ipaH基因［J］.熱帶醫學雜志，2006，6（5）：499.

［7］Fasano A，Noriega FR，Maneval DR Jr，et al.Shigella enterotoxin 1：an enterotoxin of Shigella flexneri 2aactive in rabbit small intestine in vivo and in vitro［J］.J Clin Invest，1995，95（6）：2853.

［8］Venkatesan MM，JM Buysee，DJ Kopecko，et al.Use of Shigella flexneri ipaC and ipaH gene sequences for the general identification of Shigella spp.and enteroinvasive Escherichia coli［J］.J Clin Microbiol，1989，27（12）：2687.

［9］龍北國，江麗芳.高級醫學微生物學［M］.北京：人民衛生出版社，2003.10.

［10］Buysse J M，Stover CK，Oaks EV，et al.Molecular cloning of invasion plasmid antigen（ipa）genes from Shigella flexneri analysis of ipagene products and genetic mapping［J］.J Bacteriol，1987，169（6）：2561.

［11］王 芳，馬紅芳，何 湘，等.福氏志賀菌Ⅲ型分泌系統效應子IpaH4.5功能的初步研究［J］.軍事醫學科學院院刊，2009，33（2）：120.