三氧化二砷聯合硼替佐米誘導多發性骨髓瘤RPMI8226細胞株凋亡及相關機制的研究

Aadil Yousif，牛 超，李 薇，蒿姍姍，徐效義，崔久嵬

（吉林大學第一醫院 腫瘤中心，吉林 長春 130021）

三氧化二砷聯合硼替佐米誘導多發性骨髓瘤RPMI8226細胞株凋亡及相關機制的研究

Aadil Yousif，牛 超，李 薇，蒿姍姍，徐效義，崔久嵬＊

（吉林大學第一醫院 腫瘤中心，吉林 長春 130021）

目的 本研究旨在探討三氧化二砷與硼替佐米聯合應用對多發性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）細胞株RPMI8226細胞凋亡的影響及其相關機制。方法CCK-8法檢測三氧化二砷與硼替佐米聯合應用對RPMI8226細胞增殖的抑制作用；采用流式細胞術檢測兩種藥物誘導RPMI8226細胞凋亡情況及各藥物組處理前后的細胞表面死亡受體4（death receptor 4，DR4）和死亡受體5（death receptor 5，DR5）表達的變化；Western blot檢測各藥物組Bcl-2、caspase-3、caspase-8、caspase-9和PARP蛋白表達水平的變化。結果三氧化二砷與硼替佐米聯合組對RPMI8226細胞生長抑制明顯高于三氧化二砷單藥組，細胞凋亡率均較三氧化二砷單藥組明顯增多，細胞表面DR4和DR5表達明顯增高。與三氧化二砷或硼替佐咪單藥組相比較，聯合用藥組RPMI8226細胞Bcl-2表達下調明顯，而caspase-3，caspase-8和caspase-9表達上調明顯。結論硼替佐米可以增加RPMI8226細胞對三氧化二砷誘導凋亡的敏感性，這可能與Bcl-2的表達下調及caspase-3、caspase-8、caspase-9和PARP蛋白的表達上調有關。

多發性骨髓瘤；硼替佐米；三氧化二砷；協同作用

（ChinJLabDiagn，2012，16：1801）

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是最為常見的血液系統惡性腫瘤之一。近年來，一些新型的分子靶向藥物，例如硼替佐米（bortezomib，BZ），明顯提高了MM的緩解率，但其治療仍存在復發和耐藥的問題。雖然三氧化二砷（arsenic trioxide，ATO）為復發難治多發性骨髓瘤的提供了一種新的治療手段，但目前臨床試驗顯示，單用ATO仍有55%-80%患 者治療無效［1］。本 研 究 基 于 BZ 和ATO具有不同的作用機制，選用MM細胞株RPMI8226細胞為研究對象。通過研究BZ與ATO聯合作用于RPMI8226細胞的效果，探討BZ是否能夠增強RPMI8226細胞對ATO凋亡的敏感性，并對其機制進行探討，為臨床上治療多發性骨髓瘤提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

多發性骨髓瘤RPMI8226細胞株購于美國ATCC；RPMI-1640、胎牛血清和PBS（Gibco公司）；硼替佐米（西安楊森公司）；三氧化二砷即亞砷酸氯化鈉注射液（哈爾濱伊達藥業公司）；6孔及96孔板培養板（Coring公司）；CCK-8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（武漢博士德）；Annexin V-FITC／PI細胞凋亡雙染試劑盒（Bender公司）；Bcl-2、caspase-3、caspase-8、caspase-9、PARP 單 抗、β-actin、DR4、DR5鼠抗人一抗多克隆抗體（Santa Cruz公司）；兔抗鼠二抗多克隆抗體（中杉金橋）；Western blot試劑盒（KPL公司）；FACScan型流式細胞儀（BD公司）；酶標儀（BIO-TEK公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 多發性骨髓瘤RPMI8226細胞株懸浮培養于含10%滅活胎牛血清的RPMI1640培養液（內含2mmol／L谷氨酰胺）中，置于5%CO2飽和濕度的37℃培養箱培養。每48h傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測BZ聯合ATO后細胞生長情況 收集對數生長期的RPMI8226細胞，調整細胞懸液濃度為1×106個／ml，接種于96孔板，100μl／孔。結合參考文獻及預實驗結果，BZ和ATO分別選取終濃度為20nmol／L及2μmol／L、5μmol／L。實驗共設4組為：單藥BZ（20nmol／L）處理組；單藥ATO（0、2μmol／L 和 5μmol／L）處 理 組；BZ（20 nmol／L）聯合 ATO（2μmol／L、5μmol／L）處理組；對照組（加同體積PBS）。于培養箱內培養48h后，每孔加入10μl CCK-8，5%CO2飽和濕度的37℃培養箱繼續培養4h后，利用酶聯免疫檢測儀測量各孔在490nm下的吸光度（OD）。每組實驗重復3次，根據金（正均）式公式來判定兩種藥物之間的相互作用。

Q＝E（a＋b）／（Ea＋Eb-Ea×Eb），式中Ea為ATO單藥組的細胞抑制率，Eb為BZ單藥組的細胞抑制率，E（a＋b）為聯合用藥組的細胞抑制率。當Q＜0.85時，兩種藥物為拮抗作用；當0.85≤Q＜1.15時，兩種藥物為單純相加，當1.15≤Q時，兩種藥物為協同作用。

1.2.3 流式細胞儀 Annexin V-FITC／PI染色法檢測細胞周期及凋亡情況 收集對數生長期的RPMI8226細胞，調整細胞密度為1×106個／ml，接種于6孔板，3ml／孔。實驗分為ATO單藥組（終濃度為5.0μmol／L）、BZ單藥組（終濃度為20nmol／L）、兩藥聯合組以及對照組（加同體積的PBS），培養48h后收集各組細胞。按細胞凋亡檢測試劑盒說明書以Annexin V-FITC及PI標記細胞，于1h內用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，每組實驗重復3次。

1.2.4 流式細胞儀檢測兩種藥物聯合后細胞表面DR4和DR5的表達情況 收集對數生長期的RPMI8226細胞，調整細胞懸液濃度為1×106個／ml，分為ATO單藥組（終濃度為5.0μmol／L）、BZ單藥組（終濃度為20nmol／L）、兩藥聯合組以及對照組（加入同體積PBS），培養48h后收集各組細胞。加入鼠抗人DR4和DR5單克隆抗體工作液各100 μl，充分混勻后，4℃孵育30min。PBS洗滌3次，加入FITC標記的山羊抗小鼠的二抗，混勻后，4℃避光孵育30min，PBS洗滌2次，流式細胞儀檢測，每組實驗重復3次。

1.2.5 Western blot 檢 測 藥 物 作 用 后 Bcl-2、caspase-3、caspase-8、caspase-9及 PARP 蛋白 水 平檢測 收集各組藥物作用后的RPMI8226細胞，加入預冷的PBS洗滌2遍，以1×107個／ml加入細胞裂解液（50mmol／L pH 8.0Tris-HCl，150mmol／L NaCl，1%Triton X-100，100μg／ml PMSF）置冰上30min后，13 000rpm，4℃離心20min，取上清，Bradford法測定蛋白濃度。蛋白樣品行12-15%的SDS-PAGE后，轉移至PVDF膜。含5%脫脂牛奶的 TBST封閉30min，分別用Bcl-2單抗、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及 PARP 抗體4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10min。二抗37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10min，然后顯影曝光。以β-actin為內參照，統計數據以供分析。

1.2.6 統計學方法 采用SPSS17.0軟件，組間比較用方差分析，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BZ聯合ATO作用后對細胞增殖的影響

經CCK-8檢測兩種藥物單獨應用及聯合應用對RPMI8226細胞增殖能力的影響。結果發現，隨著ATO藥物濃度的增加，其對RPMI8226細胞增殖的抑制作用增強；20nmol／L的BZ分別聯合2 μmol／L和5μmol／L的ATO對RPMI8226細胞作用后，計算Q值分別為1.30和1.27，說明BZ聯合ATO作用于RPMI8226細胞，具有協同抑制作用（如圖1）。

2.2 BZ與ATO聯合對RPMI8226細胞凋亡的影響

分別對ATO單藥組、BZ單藥組、兩藥聯合組及對照組的細胞，按細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行Annexin V和PI染色后利用流式細胞術檢測進行細胞凋亡情況檢測。如圖2所示：BZ單藥組、ATO單藥組及兩藥聯合組的細胞凋亡率分別為14.8%、16.3%及36.5%，與對照組（3.2%）相比，P＜0.01，有統計學意義。

2.3 兩藥聯合對RPMI8226細胞表面DR4和DR5表達的影響

RPMI8226細胞經單藥ATO、BZ以及兩藥聯合作用后，經流式細胞儀檢測對細胞表面DR4和DR5的表達的變化。如圖3所示：單藥組作用后，細胞表面DR4和DR5的表達均具有一定程度的升高，且兩藥聯合組升高的更為明顯，與對照組相比，P＜0.01，有統計學意義。

圖1 ATO單獨用藥及聯合用藥對RPMI8226細胞的生長抑制曲線

圖2 單獨用藥及聯合用藥對RPMI8226細胞的凋亡影響

圖3 單獨用藥及聯合用藥對RPMI8226細胞DR4和DR5表達的影響

2.4 BZ 聯 合 ATO 對 Bcl-2，caspase-3，caspase-8，caspase-9及PARP蛋白表達的影響

為了進一步研究BZ聯合ATO對多發性骨髓瘤RPMI8226細胞增殖抑制作用的機制，我們檢測了細胞內抗凋亡蛋白Bcl-2的水平及誘導細胞凋亡的caspase-3，caspase-8，caspase-9及 PARP蛋白表達水平。結果提示，單獨使用ATO或者單獨使用BZ均 能 夠 降 低 Bcl-2 的 表 達，并 使 caspase-3、caspase-8、caspase-9和 PARP 的表達增加，兩藥聯合后可使上述作用增強（如圖4）。

圖4 單獨用藥及聯合用藥對Bcl-2，Caspase-3、8、9及PARP蛋白表達的影響

3 討論

迄今為止，多發性骨髓瘤仍是一種不可治愈性疾病，新的有效的治療方案是提高MM緩解率和延長生存期的關鍵。本研究結果顯示BZ具有增強ATO對多發性骨髓瘤RPMI8226細胞生長抑制生長和促進凋亡的作用。

誘導細胞凋亡主要通過內源性途徑和外源性途徑兩種，其中外源性（或死亡受體）途徑包括腫瘤壞死因子（TNF）家族受體和配體，激活caspase-8；內源性途徑包括線粒體成分釋放調控的激活，活化caspase-9，兩條徐徑均通過激活caspase-3而誘導凋亡［2］。本實驗中 BZ聯合 ATO 對細胞caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白表達較單用藥組均有明顯增強，提示二者聯合應用是通過此作用來實現的。Caspase家族與Bcl-2被認為是與細胞凋亡發生與調節密切相關［3］。本研究也檢測了Bcl-2的表達，顯示BZ與ATO具有協同降低bcl-2表達，提示其可能通過降低此抗凋亡蛋白的表達，而促進內源性凋亡途徑的激活。

為進一步明確二者聯合應用是如何增加caspase的表達，本實驗對其上游調控因子進行了研究。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）是近年發現的TNF家族成員，其受體屬于TNF受體超家族［4，5］。多發性骨髓瘤細胞表達DR4和DR5并通過與配體TRAIL結合有效地激活外源性凋亡途徑，導致Caspase-8激 活，誘 導 凋 亡［6，7］。 本 研 究 結 果 顯 示，ATO、BZ均可誘導MM細胞凋亡受體分子DR4、DR5表達上調，且二者具有協同作用。DR4、DR5表達與誘導MM細胞凋亡的信號轉導途徑密切相關，DR4和DR5表達上調可增加TRAIL與受體結合的概率，間接提高了TRAIL的活性，促進細胞凋亡，提示BZ與ATO協同促凋亡作用部分是由此通路介導的。

綜上所述，BZ聯合ATO具有協同激活內源性和外源性凋亡通路，抑制多發性骨髓瘤RPMI8226細胞增殖和促進其凋亡，兩者合用有可能為多發性骨髓瘤臨床治療開辟一條新途徑。

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［2］Twomey C，McCarthy JV..Pathways of apoptosis and importance in developement［J］.Journal of Cellular and Molecular Medicine，2005，9（2）：345.

［3］Cory S，Adams JM.The Bcl2family：regulators of the cellular life-or-death switch［J］.Nature，2002，2（9）：647.

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Apoptosis of RPMI8226cell induced by arsenic trioxide combined with bortezomib and its mechanism

AadilYousif，NIUChao，LIWei，etal.（CancerCenteroftheFirstHospitalofJilinUniversity，Changchun130021，China）

ObjectiveTo investigate the effects of arsenic trioxide and bortezomib on apoptosis of human multiple myeloma RPMI8226cells and its mechanism.MethodsCell proliferation was detected by CCK-8method to study the role of arsenic trioxide and bortezomib in RPMI 8226cells.Cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry.The expression of cell surface death receptor 4（DR4）and death receptor 5（DR5）was also measured by flow cytometry.Western blot was applied to detecte the expression level of Bcl-2，caspase-3，caspase-8 ，caspase-9and PARP protein.ResultsThe group of arsenic trioxide combind with bortezomib showed more inhibitory effect on RPMI 8226cells than that of arsenic trioxide group.The apoptosis rate was significantly increased than arsenic trioxide group.The expression of DR4and DR5on the cell surface was significantly increased.Compared with arsenic trioxide group，the expression of Bcl-2was significantly decreased in the combined treatment group，while the expression of caspase-3，caspase-8，caspase-9and PARP were significantly increased.ConclusionIt is concluded that bortezomib can enhance sensitivity of RPMI8226to apoptosis by arsenic trioxide，which may be associated with decreasing the expression of Bcl-2and increasing the expression of caspase-3，caspase-8，caspase-9and PARP protein.

multiple myeloma；bortezomib；arsenic trioxide；apoptosis

R733.3

A

1007－4287（2012）10－1801－04

國家青年自然基金（30901702），吉林省中醫藥局項目（2010-pt057），吉林省中青年領軍人才創新團隊項目（20111807），吉林大學杰出青年基金（201005001）

＊通訊作者

Aadil Yousif（1974-），男，在讀博士。

2012－05－24）