siRNA抑制人肝癌細胞MDM2表達及細胞增殖的研究

趙燕穎，李亞剛，楊澤成，張舵舵，趙春燕

（1.吉林大學第四臨床醫院 內科，吉林 長春 130011；2.吉林大學中日聯誼醫院 普外科，吉林 長春130033；3.吉林大學 白求恩醫學院 生理學系，吉林 長春 130021）

siRNA抑制人肝癌細胞MDM2表達及細胞增殖的研究

趙燕穎1，3，李亞剛1，楊澤成2，張舵舵2，趙春燕3＊

（1.吉林大學第四臨床醫院 內科，吉林 長春 130011；2.吉林大學中日聯誼醫院 普外科，吉林 長春130033；3.吉林大學 白求恩醫學院 生理學系，吉林 長春 130021）

目的 探討siRNA對人肝癌HepG2細胞MDM2基因表達的抑制作用及對增殖的影響。方法體外合成針對MDM2基因的siRNA質粒，轉染HepG2細胞株；應用RT-PCR和western blot方法檢測siRNA對MDM2和P53基因和蛋白表達的影響，并用MTT法檢測siRNA對細胞增殖抑制作用，流式細胞儀檢測細胞周期。結果和空白組比轉染siMDM2-1，2的HepG2細胞的MDM2基因和蛋白表達減低，而P53基因和蛋白表達增加。陰性對照質粒組的基因表達未見明顯改變。轉染siRNA MDM2后細胞生長受到抑制，轉染siMDM2-1，2和陰性對照質粒后的抑制率分別是46.3%、56.1%和3%。和對照組比較，轉染siMDM2-1，2的hepG2細胞的細胞周期發生明顯改變，而轉染對照質粒的hepG細胞周期未發生明顯變化。結論siRNA MDM2可以有效抑制HepG2細胞株中MDM2的表達，促進P53的表達，同時可以使細胞周期發生變化，這可能是其抑制腫瘤細胞增殖的主要機制之一。

肝細胞癌；MDM2；si RNA；凋亡

（ChinJLabDiagn，2012，16：1790）

肝癌的發生涉及多種致病原因和危險因素。目前，原癌基因、抑癌基因、凋亡基因等癌癥相關基因的過度表達被認為是肝癌發生的主要原因［1］。MDM2是p53調控網絡中的下游基因，作為p53的重要調節因子，參與細胞生長抑制、凋亡、細胞周期調控等過程。MDM2作為原癌基因具有泛素化－蛋白酶降解抑癌基因p53的功能，從而抑制細胞凋亡促進細胞增殖［2，3］。本研究中，我們構建了針對人MDM2特異性發卡狀siRNA （small interfering RNA）質粒表達載體，并成功轉染人肝癌HepG2細胞，進一步研究其沉默MDM2對其增殖的影響和初步探討其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料胎牛血清、IMDM培養基 （GBICO）；M-MLV逆轉錄和PCR試劑盒（Invitrogen）、SilencerTM siRNA construction kit（Ambion公司）；LipofectamineTM2000轉染試劑盒（Invitrogen公司）；引物由上海生工生物技術公司合成；細胞株（中國科學院上海細胞所）。

1.2 siRNA的設計和合成根據已知Genebank MDM2mRNA序列和siRNA的設計原則［4］，利用Ambion公司的在線設計來尋找靶序列，并做同源序列搜索，排除那些和其他編碼序列或EST同源的序列。用silencerTM siRNA construction kit體外合成 si-MDM2 1，si-MDM2 2，陰性對照（control siRNA）購于Ambion，與任何編碼序列無同源性。

1.3 細胞培養及轉染人肝癌細胞株HepG2細胞于IMDM培養液 （含10% 新生牛血清，青霉素100μg／ml，鏈霉素100μg／ml）中，37℃5%CO2孵箱內培養，常規更換生長液、消化傳代，實驗用細胞均處于對數生長期。胰酶消化處于對數生長期的細胞并計數，傳代于孔板或培養瓶，在無抗生素的培養基中培養24h后，細胞融合率達80%－95%時開始轉染。操作按LipofectamineTM 2000試劑說明書進行。

1.4 RT-PCR檢測基因表達轉染后72h收集各組siRNA MDM2和control siRNA細胞，按Trizol操作說明，分別提取總RNA，紫外分光光度計定量。RNA樣品經逆轉錄反應合成cDNA，然后進行PCR擴增，RT-PCR所有操作均按RT-PCR試劑盒說明書進行。以βactin做為內參，MDM2擴增產物為300bp，上游引物5’-AACCACCTCACAGATTCCAG-3’，下游引物5’-TCAAGGTGACACCTGTTCTC-3’；P53擴增引物為490bp，上游引物5＇-GTGGTGGTGCCCTATGAG-3＇；下 游 引 物 5＇-GGGAGGTAGACTGACCCTTT-3＇；β-actin 擴 增 產 物為520bp，上游引物：5’2GGGACCTGACAGACTACCT23’下游引物：5’2CGTACTCCTGCTTGCTGA23’。擴增條件：94℃變性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，30個循環，最后72℃延伸7分鐘。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠系統電泳（含溴化乙啶），拍照鑒定。用 Pharmacia ImageMaster凝膠成像儀觀察，并用ImageMaster軟件分析條帶峰面積，轉染各組信號值相對于對照組的百分率進行統計作圖。

1.5 Western blot檢測蛋白表達細胞轉染后培養72h，用PBS清洗后加預冷的裂解液，收集細胞，輕微超聲粉碎細胞10s，測蛋白質濃度，取50μg蛋白上樣，12%SDS PAGE電泳，并轉印到硝酸纖維素膜上。含有樣品的硝酸纖維素膜用10g／L脫脂奶粉4℃封閉過夜后用配制的TBST洗，用按1∶200稀釋的兔抗人MDM2、wtP53和βactin單克隆抗體37℃振蕩反應2h，用TBST洗。然后用按1∶1 000稀釋的山羊抗兔二抗37℃反應1h，TBST洗，DAB法顯色。用圖像分析系統測定各條帶灰度值，來反映蛋白的表達變化。

1.6 MTT法檢測細胞增殖抑制取對數生長期HepG2細胞以5×103／孔接種于96孔板，培養至細胞貼壁后，轉染2組siRNA MDM2和control siRNA使其終濃度達50nmol／L，未處理組加入相應體積的PBS，轉染24，48，72h后，每孔加入15μl MTT（5mg／ml）培養4h，再加入150μl／孔的DMSO，振蕩10min，用酶標儀570nm處測定吸光度（A）值。根據公式：細胞增殖抑制率（%）＝ （1－處理組吸光度／未處理組吸光度）×100%，計算出抑制率。每組均設3個平行孔（取平均值作為1次實驗結果），并重復3次實驗。

1.7 流式細胞術檢測細胞周期按1×106／瓶將對數生長期細胞接種到培養皿中，分別轉染2組的siRNA MDM2和control siRNA。培養72h，用消化法收集細胞，用冷PBS充分洗滌，制備成單細胞懸液，用70%乙醇處理過夜，碘化丙啶染色，流式細胞儀檢測細胞周期。每組均設3復管，并重復3次。

1.8 統計學方法采用SPSS13.0統計軟件。采用成組t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 重組質粒酶切和測序鑒定PGCsilencerTMMDM2siRNA經HindⅢ和BamHⅠ雙酶切后呈2條帶，分成大的載體片段和小的目的片段，見圖1。將重組質粒PGCsilencerTM-MDM2-siRNA送上海生 工 測 序 （測 序 號 D02.CS060503093＿0253.SD13D229-1.F；D04.CS060503093 ＿0255.SD13D230-1.F），引物序列根據載體序列，采用 Primer-Premier5.0設計為：5′-AAGAAGAGAGTGTGGAATCTA-3′。結果表明siRNA表達模板成功構建于PGCsilencer載體上，序列完全正確，與目的序列相同。

圖1 重組質粒雙酶切鑒定

2.2 siMDM2轉染后對hepG2細胞MDM2和P53基因表達的影響半定量RT-PCR檢測結果顯示MDM2，P53和β-actin引物的擴增基因片段經電泳和EB染色后，結果顯示擴增片段大小與所設計的大小完全一致。和轉染control siRNA及空白組的hepG2細胞比較轉染si2MDM2-1、si2MDM2-2的hepG2細胞中MDM2mRNA的表達水平顯著減低，而P53mRNA表達水平明顯增加（如圖2）。而和空白組比較control siRNA組各基因表達水平無明顯改變。統計分析結果表明，轉染si-MDM2-1、si-MDM2-2和control siRNA 的hepG2中 MDM2－mRNA的表達量分別下降至空白組的39.06%，32.61%和94.8%，si-MDM2組和空白組比轉染差異有顯著性，P＜0.05；control siRNA與空白組比無明顯差異，P＞0.05。和空白組比較轉染si MDM2組P53mRNA表達水平分別上調46.2%和52.1%左右（P＜0.05）；control siRNA 組無明顯改變，P＞0.05。

2.3 siMDM2轉染后對hepG2細胞MDM2和P53蛋白因表達的影響western blot結果顯示hepG2細胞轉染后各組β-actin蛋白表達量基本相同，陰性對照組和空白組的各目的蛋白表達量相似，siRNA MDM2-1和siRNA MDM2-2組的各目的蛋白表達量相似，差異均無統計學意義（P＞0.05）。和對照組比較，轉染2組siRNA MDM2的MDM2蛋白表達量有不同程度的下調，P53蛋白表達水平有不同程度上調，差異均具有統計學意義（P＞0.05）。和空白組比較轉染2組si MDM2的 MDM2／β-actin平均下調56.80%；wtP53／β-actin平均上調44.9%。如圖3

圖2 轉染后各組hepG2中MDM2mRNA和P53mRNA的表達的變化

2.4 siMDM2轉染后對hepG2細胞增殖的影響siRNA MDM2轉染后用MTT顯色法檢測96孔板細胞在不同時間的吸光值，根據存活細胞數量與吸光值呈正比的原理，按細胞增殖抑制率，轉染siMDM2后細胞的增殖速度和分裂指數均低于空白組，而且抑制率在0－72小時時間范圍內隨時間的增加而增高（P＜0.05），如圖4。control siRNA和空白組比較細胞增殖差異無顯著性（P＞0.05）。

圖3 轉染后各組hepG2中MDM2mRNA和P53蛋白的表達的變化

圖4 轉染后各組hepG2細胞增殖抑制率

2.5 siMDM2轉染后對hepG2細胞周期的影響流式細胞儀檢測結果顯示轉染siMDM2-1，2后引起hepG2細胞的細胞周期發生改變，使處于G0／G1期細胞明顯增加，S期細胞明顯減少，如圖5。

圖5 轉染后各組hepG2細胞周期變化

3 討論

MDM2可以與野生型P53蛋白形成復合體，對P53起負調節作用，使P53受到抑制或完全失活，在腫瘤發生發展中發揮重要作用［5］。當有致癌因素時，P53基因突變，失去抑癌功能，原癌基因MDM2被激活，表達相應蛋白P90，通過與P53蛋白結合，進一步使P53功能喪失，從而導致腫瘤的發生［6］。研究表明，MDM2作為一個原癌基因，在腫瘤發生和發展過程中發揮重要作用，MDM2在一些軟組織肉瘤中的擴增與表達和腫瘤轉移、復發有關。Zhang MF等［7］報道 MDM2癌基因在原發性肝細胞癌明顯過度表達，并可能參與腫瘤轉移，故認為MDM2與肝癌的發生，發展和轉移有關。

SiRNA可以特異性地降解相應基因的mRNA，從而抑制該基因的表達，siRNA每一條鏈均有2個核苷酸3′突出端，介導識別并靶向切割同源性靶mRNA分子而實現的，其作用類似于基因敲除，但較其技術簡單、快捷［8，9］。siRNA技術較其他單克隆抗體和反義核苷酸方法，具有更高的效率性和特異性：微量的siRNA即可使其編碼致病基因產物的含量明顯下降，達到剔除的效果；同時，siRNA的抑制作用具有嚴格的序列特異性，治療的針對性強，副作用小。因此，siRNA技術為腫瘤基因治療提供了一個新的可供選擇的策略和技術平臺，siRNA技術可能成為治療人類腫瘤和其他疾病的一個新的重要工具。

我們根據siRNA設計原則設計合成了2對針對在肝細胞肝癌高表達的MDM2基因的干擾位點序列的siRNA MDM2。將構建的siMDM2真核表達質粒轉染至hepG2細胞后進行基因和凋亡的檢測。RT-PCR結果顯示siMDM2能有效地阻抑MDM2基因的表達，和空白組比較，平均基因表達下調64.7%；同時，增強P53基因的表達，和空白組比較，平均基因表達上調49.1%。MTT檢測結果顯示：瞬時轉染siMDM2能有效抑制hepG2細胞增殖，使細胞增殖速度減慢，且隨著轉染時間延長，增殖抑制率逐漸增加，差異具有顯著性，但轉染control si RNA組細胞增殖與空白組比為見明顯差異。流式細胞術檢測結果顯示siMDM2可使腫瘤細胞發生細胞周期阻滯：處于S期細胞減少，G0／G1和G2／M期細胞增多。而轉染control si RNA組細胞未見明顯細胞周期改變。

SiRNA MDM2能抑制MDM2基因和上調P53基因表達，從而抑制腫瘤細胞增殖和使細胞發生周期阻滯，本研究組已經在siRNA MDM2對骨肉瘤增殖和凋亡的影響研究中證明了合成的siMDM2的有效性［10］，本研究進一步證明了此重組質粒可以抑制腫瘤細胞增殖，提示在肝癌治療中，以MDM2基因為靶點，利用siRNA技術進行基因治療有可能成為一種新的有效手段。本研究為后續的長效抑制腫瘤的研究工作提供了新思路和實驗數據。

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siRNA inhibits MDM2expression and proliferation of hepatoma carcinoma cell

ZHAOYan-ying1，LIYa-gang1，YANGZe-cheng2，etal.（1.DepartmentofInternalMedicine，theFourthHospitalofJilinUniversity，Changchun130011，China；2.DepartmentofSurgery，China-JapanUnionHospital，JilinUniversity，Changchun130033，China）

ObjectiveUsing siRNA to downregulate MDM2expression in hepatocellular carcinoma cell line hepG2，to observe the influence of siRNA of cell proliferation and apoptosis.MethodsMDM2-siRNAs against the MDM2gene were designed and transfected into hepG2cells respectively，MDM2and P53gene and protein expression was measured using RT-PCR and western blot，Cell proliferation was measured with MTT assay，the cell cycle were analysed using flow cytometer.ResultsMDM2mRNA and protein expression were inhibited and P53mRNA and protein expression were enhanced after transfecting with two siRNA MDM2respectively.As a consequence，cell growth inhibition was observed，cell cycle change was observed after transfecting with two siRNA MDM2too.ConclusionsiRNA against MDM2could effectively downregulate MDM2and upregulate P53expression in hepG2cell line，inhibit cell proliferation and change cell cycle.

hepatocellular carcinoma；MDM2；si RNA；apoptosis

R735.7

A

1007－4287（2012）10－1790－04

＊通訊作者

2011－09－03）