血清載脂蛋白A5ELISA的建立及其初步應(yīng)用

翟光華，李美芬，朱超望

（蘇州市立醫(yī)院北區(qū) 檢驗科，江蘇 蘇州 215008）

血清載脂蛋白A5ELISA的建立及其初步應(yīng)用

翟光華，李美芬，朱超望

（蘇州市立醫(yī)院北區(qū) 檢驗科，江蘇 蘇州 215008）

目的 建立人血清中載脂蛋白A5（ApoA5）雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），并初步觀察其在2型糖尿病（T2DM）中的應(yīng)用價值。方法用棋盤滴定法確定捕獲抗體、檢測抗體的最佳工作濃度；繪制標準曲線，確定線性范圍、檢測限；檢測該方法的精密度和特異性，并分別檢測T2DM患者及健康人血清中ApoA5水平以及其它生化指標。結(jié)果本研究建立的方法測定范圍為5－640ng／ml，最低檢出量2ng／ml，批內(nèi)和批間變異系數(shù)（CV）分別為5.6%和6.7%。T2DM患者血清中ApoA5水平為（494.2±233.1）ng／ml，顯著低于健康對照組（668.2±357.0ng／ml，P＝0.001）；血清 ApoA5濃度與 HDL-c呈正相關(guān)（r＝0.16，P＝0.031），與TG呈負相關(guān)，但是沒有達到統(tǒng)計學(xué)差異（r＝－0.028，P＝0.717）。結(jié)論本研究建立的人血清ApoA5雙抗體夾心ELISA靈敏度高，特異性好，可應(yīng)用于臨床ApoA5的檢測；ApoA5可能是T2DM的獨立危險因素，監(jiān)測ApoA5濃度對于T2DM的預(yù)防和干預(yù)具有一定臨床意義。

載脂蛋白A5；酶聯(lián)免疫吸附試驗；糖尿病；血脂

（ChinJLabDiagn，2012，16：1755）

載脂蛋白A5（ApoA5）是2001年由兩個獨立課題組［1，2］在 APOA1／C3／C4基因簇中發(fā)現(xiàn)并被證實的一個載脂蛋白家族新成員，其參與調(diào)節(jié)血脂代謝，尤其與三酰甘油（TG）關(guān)系密切，是對血漿TG水平影響最為顯著的因子之一。2型糖尿病（T2DM）是一種常見病與多發(fā)病，常伴有脂質(zhì)代謝紊亂。我們先前的研究［3，4］發(fā)現(xiàn)，載脂蛋白 A5基因（APOA5）多態(tài)性與T2DM發(fā)生有關(guān)。本研究采用基因工程技術(shù)獲得大量 His-ApoA5重組蛋白，免疫Balb／c小鼠，制備抗ApoA5的單克隆抗體。建立ApoA5－ELISA雙抗體夾心法，對實驗條件和影響因素進行了探索，并初步應(yīng)用于臨床檢測，探討ApoA5蛋白水平與T2DM之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器Balb／c小鼠（蘇州大學(xué)實驗動物中心提供）、SP2／0骨髓瘤細胞株（江蘇大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)研究所惠贈）；弗氏佐劑、羊抗鼠-HRP二抗、辣根過氧化物酶（HRP）（美國Sigma公司）；四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、BSA（上海晶美生物技術(shù)有限公司）；全自動酶標分析儀（上海科華）。

1.2 一般資料本院2010年3－11月體檢中心健康人員112例，男72例，女40例，平均年齡（42.5±14.6）歲，排除各種急性應(yīng)激狀態(tài)（如急性心梗、腦梗、感染、外傷、手術(shù)等），肝腎功異常，甲狀腺功能異常以及血常規(guī) WBC≥10.0×109／L和空腹血糖FG≥6.11mmol／L者。選擇同期我院內(nèi)分泌科確診的T2DM患者62例（參考WHO1999標準診斷）作為病例組，男26例，女36例，平均年齡（59.5±15.9）歲。所有研究對象清晨空腹采集靜脈血3ml，離心取血清備用。

1.3 方法

1.3.1 抗ApoA5單抗的制備 ①動物免疫：常規(guī)免疫法免疫Balb／c小鼠，第1次用完全佐劑，第2、3次用不完全佐劑，進行腹腔注射。②細胞融合：取免疫小鼠脾細胞與SP2／0骨髓瘤細胞在50%聚乙二醇（PEG）的作用下10∶1比例進行融合，10d后檢測抗體，選取陽性孔，采用有限稀釋法克隆化，待克隆陽性率100%時，擴大培養(yǎng)，獲得7株穩(wěn)定分泌抗ApoA5單抗的亞克隆細胞株，選取其中3個OD值高的陽性細胞株制備單抗腹水，ProteinA親和層析法純化抗體。③抗體特異性測定：固相載體分別包被 ApoA5、ApoA1、ApoB和人血清白蛋白，用ELISA法測定。抗體的Ig及亞類鑒定采用雙相免疫擴散法。④抗體的效價測定：取上清和腹水，用0.9%氯化鈉溶液稀釋成不同濃度，用ELISA法測定其效價。

1.3.2 ApoA5ELISA測定方法的建立 利用1.3.1制備的抗ApoA5單抗，建立雙抗體夾心法ELISA，并對實驗條件進行優(yōu)化。利用棋盤方陣滴定法確定包被抗體和酶標抗體的使用濃度。

1.3.3 其他生化指標檢測 TG、TC和Glu采用酶法測定；HDL-c、LDL-c采用化學(xué)遮蔽法測定；LP（a）、ApoA1、ApoB和CRP采用免疫比濁法測定。所有指標均在Beckman Coulter LX20全自動化學(xué)分析儀上進行，所用試劑均為配套試劑。

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS18.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。所有檢測指標均進行正態(tài)性檢驗，各計量資料均采用均數(shù)±標準差（±s）表示。采用Pearson相關(guān)分析計算相關(guān)系數(shù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 包被抗體與酶標抗體工作濃度的選擇

為確定制備的ApoA5檢測單抗和包被單抗的最佳工作濃度，采用棋盤方陣法進行滴定。以陰性對照A450nm值＜0.1，ApoA5檢測單抗的A450nm值為1.0時的稀釋度為最佳工作濃度，以此標準確定檢測單抗的工作濃度為1∶1 000，包被單抗工作濃度為1∶2 000時曲線效果最佳。

2.2 ApoA5蛋白標準曲線及檢測限確定

以本實驗優(yōu)化好的ELISA方法，檢測已知濃度的經(jīng)系列稀釋的重組ApoA5蛋白，通過ApoA5濃度的與A450nm值繪制曲線圖（圖1），可知ApoA5在5－640ng／ml濃度范圍內(nèi)具有良好的線性，并且包括了7個標準點，確定此范圍為該方法的檢測范圍。通過對選定范圍內(nèi)的7個標準點線性回歸，獲得標準曲線，被檢抗原濃度在該濃度范圍內(nèi)能形成一條近似線性曲線（圖2），回歸方程Y＝189.329X－16.662，R2＝0.994。

圖1 ApoA5濃度與A450nm值關(guān)系圖

圖2 ApoA5測定標準曲線

2.3 方法學(xué)考核①檢測限：以方陣滴定法所確定的最佳濃度配比檢測梯度稀釋的重組ApoA5蛋白，得本方法的檢測限。當重組ApoA5蛋白為2 ng／ml時陽性／陰性（P／N值）＞2.1，故該雙抗體夾心ELSIA檢測限為2ng／ml。②精密度：兩份不同血清樣本同批連續(xù)測定8次，批內(nèi)平均CV為5.4%和5.9%，平均批內(nèi)CV為5.6%；兩份樣本分6次測定，其批間CV分別為6.5%和6.8%，平均批間CV為6.7%。③ELISA特異性實驗：以新建立的雙抗體夾心ELISA法進行BSA、ApoA1以及人血清白蛋白與ApoA5單抗特異性檢測，沒有發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)，表明該ELISA方法具有良好的特異性。

2.4 初步臨床應(yīng)用

檢測所有對象血清ApoA5濃度，如表1所示。T2DM 組血清 ApoA5濃度為494.2±233.1ng／ml，顯著低于健康對照組（668.2±357.0ng／ml，P＝0.001）。按性別分組后，這種差異女性（485.6±238.3ng／ml vs 672.2±349.0ng／ml，P＝0.009）較男性（506.2±229.9ng／ml vs 666.0±363.8ng／ml，P＝0.039）更為明顯。然而，在健康對照組和T2DM組，男性血清ApoA5濃度與女性血清ApoA5濃度無明顯差異（P＞0.05）。總?cè)巳褐校匝錋poA5濃度（583.8±314.0.sng／m1）低于男性（623.6±339.9ng／ml），但無顯著性差異（P＝0.430）。在總?cè)巳海錋poA5濃度與BMI、CRP和年齡均呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為－0.36、－0.17和-0.23（P＜0.05），與 HDL-c呈正相關(guān)（r＝0.16，P＝0.031）。ApoA5與TG呈負相關(guān)，但是沒有達到統(tǒng)計學(xué)差異（r＝－0.028，P＝0.717），與其它血脂指標無明顯相關(guān)性。這種相關(guān)性男性和女性無明顯差別。

表1 研究對象血清ApoA5濃度的比較（ng／ml）

3 討論

動物實驗和臨床研究證明ApoA5在體內(nèi)TG代謝過程中發(fā)揮重要作用，敲除APOA5基因小鼠的血漿TG水平約是正常對照的4倍，同時伴有極低密度脂蛋白（VLDL）的升高；相反，轉(zhuǎn)入人APOA5基因的小鼠，其血漿TG水平下降66%，VLDL亦有下降；這些表明ApoA5表達與TG呈高度負相關(guān)［1，2］。而ApoA5僅在肝臟中表達，血漿中的濃度非常低，不到 ApoA1的0.1%［2］。因此，建立一種靈敏度高、特異性強的檢測方法具有重要的臨床意義。

本文建立的雙抗體夾心ELISA僅對ApoA5反應(yīng)，與其他無關(guān)抗原無交叉反應(yīng)，檢測靈敏度，重復(fù)性好，批內(nèi)和批間變異低，檢測方法準確可靠。本研究檢測中國人血清ApoA5濃度發(fā)現(xiàn)健康人血清ApoA5濃度為668.2±357.0ng／ml，與Pennacchio等［1］報道的血清ApoA5濃度一致，但比高加索人和日 本 人 的 ApoA5 濃 度 高［5，6］。 這 與 一 些 報 道APOA5SNP的稀有等位基因在亞洲人包括中國人中更多見不一致，這種差異的出現(xiàn)考慮可能與種族差異有關(guān)。

本文研究結(jié)果顯示，T2DM組血清ApoA5濃度降低，與以前的報道ApoA5多態(tài)性中稀有等位基因伴有T2DM危險增加一致，揭示血清ApoA5降低與T2DM的危險增加相關(guān)，不依賴于血脂、BMI、年齡等已知的T2DM 危險因素，提示血清ApoA5濃度可能為T2DM危險的獨立預(yù)測因子。然而，ApoA5在T2DM的作用機制目前尚不清楚。ApoA5在TG代謝中激活脂蛋白脂酶（LPL）促進脂解作用和增加VLDL的清除，可以解釋ApoA5的保護作用［7，8］。

［1］Pennacchio LA，Olivier M，Hubacek JA，et al.An apolipoprotein influencing triglycerides in humans and mice revealed by comparative sequencing.Science，2001，294：169.

［2］Van der Vliet HN，Sammels MG，Leegwater ACJ，et al.Apolipoprotein A-V：a novel apolipoprotein associated with an early phase of liver regeneration.J Biol Chem，2001，276：44 512.

［3］Zhai G，Wen P，Guo L，et al.Association of c.553G＞T Polymorphism in Apolipoprotein A5Gene with Type 2Diabetes Mellitus in Chinese Population.Clin Chem Lab Med，2006，44（11）：1313.

［4］翟光華，聞 平，郭蘭芳，等.2型糖尿病患者 APOA5-1131T／C基因多態(tài)性與血脂代謝和胰島素抵抗的關(guān)系研究［J］.遺傳，2007，29（5）：541.

［5］Ishihara M，KujiraokaT，IwasakiT，et al.A sandwich enzymelinked imnrunosorbent assay for hurnan plasma apolipoprotein AV concentration.J Lipid Res，2005，46：2015.

［6］O’Brien PJ，Alborn WE，Slona JH，et al.The novel apolipoprotein A5is present in human serum，is associated with VLDL，HDL，and chylomicrons，and circulates at very low concentrations compared with other apolipoproteins.Clin Chem，2005，51：351.

［7］Alborn WE，？Prince MJ，Konrad RJ.Relationship of apolipoprotein A5and apolipoprotein C3levels to serum triglycerides in patients with type 2diabetes.Clin Chim Acta，2007，378（1-2）：154.

［8］Qi L，Liu S，Rifai N，et al.Associations of the apolipoprotein A1／C3／A4／A5gene cluster with triglyceride and HDL cholesterol levels in women with type 2diabetes.Atherosclerosis，2007，192（1）：204.

Development of an ELISA method for the determination of human serum apolipoprotein A5and its preliminary clinical ap－ plication

ZHAIGuang-hua，LIMei-fen，ZHUChao-wang.（DepartmentofLaboratoryMedicine，theNorthDistrictofSuzhouMunicipalHospilal，Suzhou215008，China）

ObjectiveTo develop a double antibody sandwich enzyme-linked immunoassay（ELISA）for the detection of human apolipoprotein A5（ApoA5）and study its preliminary clinical application in type 2diabetes mellitus（T2DM）.MethodsThe best work concentration of the capture antibody and detection antibody was decided by the board titration method.The standard curve of ELISA was established to determine the linear range and detection limit.The precision and specificity of the method was determined.The serum ApoA5level and other biochemical indicators were detected in T2DM patients and healthy individuals respectively.ResultsIt was found that the measurement range of this method was 5－640ng／ml，and the minimal detectable limit was 2ng／ml，and the intra and inter-coefficients of variation（CV）was 5.6%and 6.7%.The serum ApoA5level of T2DM patients was（494.2±233.1）ng／ml，which was significantly lower than the healthy individuals（668.2±357.0ng／ml，P＝0.001）.The Pearson correlation analysis showed that the serum ApoA5level was positively correlated with the serum level of HDL-c（r＝0.16，P＝0.031），and negatively correlated with the serum level of TG，but statistical difference was not found（r＝－0.028，P＝0.717）.ConclusionThe double antibody sandwich ELISA is a sensitive，specific method for quantitative analysis of human serum ApoA5level.ApoA5may be independent risk factor for T2DM.It may have potential clinical significance in prevention and intervention of T2DM to monitor the serum ApoA5level.

apolipoprotein A5（ApoA5）；enzyme-linked immunoassay（ELISA）；diabetes mellitus；serum lipid

R466.11＋2

A

1007－4287（2012）10－1755－03

蘇州市“科教興衛(wèi)”青年人才專項基金（SWK0924）；南京醫(yī)科大學(xué)科技發(fā)展基金面上項目（09NJMUM138）

2011－03－20）