中草藥提取物體外抗菌活性測定方法的初步探討

俞曉麗 王 君 聞 平

(江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院檢驗科，江蘇省鎮(zhèn)江市電力路8號，212002)

中藥藥敏試驗方法有紙片瓊脂擴散法、試管稀釋法、平板稀釋法、打洞法、挖溝法等，目前我國尚無統(tǒng)一完整的中藥藥敏試驗方法，這給從事中藥新藥鑒定工作者帶來困惑。我們對幾種藥敏實驗方法進行了探討，并力圖尋找一個像西藥紙片瓊脂擴散法——Kirby-Bauer法一樣的一個統(tǒng)一且比較完善、理想的方法。

1 材料與方法

1.1 材料 1)菌種:臨床分離大腸桿菌、金黃色葡萄球菌各一株。2)中藥:大蒜素獲自黑龍江寶島制藥有限公司，黃芩素獲自美國SIGMA公司，胡桃楸提取物［1］(本實驗室自制)。3)培養(yǎng)基:試驗中所用MH液體培養(yǎng)基和MH瓊脂培養(yǎng)基均為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 管碟法 將試驗菌株接種于營養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18h后，用生理鹽水洗下，用比濁法配成105CFU/mL菌液，用棉簽涂抹于營養(yǎng)瓊脂平板，放上特制鋼杯，鋼杯內(nèi)徑0.5cm，高0.8cm，盛入不同濃度上述各種中藥原液0.157mL，37℃培養(yǎng)24h，測量抑菌圈大小。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)稀釋法［2］在試管中用MH液體培養(yǎng)基將各種中藥原液稀釋為 1/2、1/4、1/8，然后加入105CFU/mL菌液0.1mL，同時設(shè)不加中藥的陽性對照管，37℃培養(yǎng)18h觀察，以MH液體培養(yǎng)基混濁，無沉淀管判為陰性。

1.2.3 平板稀釋法 取無菌9cm平皿9個，每個加無菌生理鹽水2mL。根據(jù)培養(yǎng)皿底面上注明的藥物稀釋度，在第一個平皿原藥液2mL，混勻，取倍比稀釋藥液2mL至第二個平皿，以此類推至第8個平皿。第9個平皿不加藥做陰性對照。在上述的每個平皿中加入試管中的60℃培養(yǎng)基18mL，倒入培養(yǎng)基馬上搖勻，搖勻為順/逆時針7次，搖勻后，平放，冷凝。使藥液濃度為1：10，1：20，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640，1：1280;用標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)取1環(huán)受試菌液(1MacFarland單位)劃線接種于平皿內(nèi)，于32℃溫箱培養(yǎng)48h，以能抑制細菌生長的最低藥物濃度為該藥物的最低抑菌濃度(MIC)，重復(fù)3次試驗，以3次或2次結(jié)果相同者為報告依據(jù)［3］。9號平板為陰性對照。

1.2.4 活菌計數(shù)法 將各種中藥配制為原液、1/2液，以0.5mL/管分裝在有蓋塑料離心管中，然后在每管中加入已配好的105CFU/mL菌液0.1mL，同時設(shè)生理鹽水對照。試驗管和對照管置4℃冰箱保存。參照簡易式傾注平板法的計數(shù)方法［4］，即將作用后的標(biāo)本稀釋為不同濃度，每個濃度取10μL充分涂抹于瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～24h，計數(shù)菌落數(shù)，換算為每毫升含有的活菌數(shù)。對照管在試驗前，試驗管和對照管在保存不同時間后，用加樣器取4℃下作用后的試驗液10μL于營養(yǎng)瓊脂平板，用接種環(huán)充分涂抹，37℃培養(yǎng)24h后用電光菌落計數(shù)器計數(shù)菌落數(shù)。

1.2.5 刃天青微孔板顯色法 在96孔微孔板(Costar USA)上實驗組加入上述細菌懸液100μL/well，再加入不同稀釋度的中藥液(100μL/well)，設(shè)不加藥的細菌對照組和無細菌的空白對照組，每個培養(yǎng)條件設(shè)3個復(fù)孔。置35℃孵箱培養(yǎng)18h，每孔加入刃天青溶液(5mg/mL)10μL，繼續(xù)培養(yǎng)2h后在全自動酶標(biāo)儀上以492nm波長測定實驗組與對照組的吸光度(A值)，按下列公式計算:細菌細胞存活率［5］=實驗組A值/藥物陰性對照組A值×100%。結(jié)果判定:根據(jù)刃天青微孔板顯色法的活菌計數(shù)，細菌存活率可套用上述公式。

細菌存活率＜30%則對該藥為高度敏感(S);細菌存活率30%～50%則對該藥為中度敏感(MS);細菌存活率＞50%則對該藥為不敏感(R)。

2 結(jié)果與評價

紙片瓊脂擴散法中由于中藥的煎劑及其他劑型做成的液體都是懸液，藥物在固體培養(yǎng)基上擴散受到限制，效果不好，不易得出準(zhǔn)確的結(jié)果;試管稀釋法是一個比較好的方法，但具有試驗工作量大，操作繁瑣，一個系列稀釋度含藥培養(yǎng)基只能測一種菌，營養(yǎng)要求高的菌無法培養(yǎng)等弊端，難以推廣;打洞法同紙片擴散法，也因中藥煎劑都是懸液，顆粒較粗，擴散受到限制，實驗結(jié)果難以控制，而在臨床上不能作為一個標(biāo)準(zhǔn)方法推廣;平板稀釋法，只需制成兩個系列稀釋度含藥平板，一個稀釋度可同時測多種細菌，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確;采用活菌計數(shù)法，用中藥原液可以測出用管碟法所不能測出的中藥抑菌作用。在1/2濃度中，試管法只能測出20%試驗藥的抑菌作用，而活菌計數(shù)法則能測出所有試驗藥對細菌的作用。但采用活菌計數(shù)法進行實驗，在試驗前需對試驗菌在生理鹽水中存活情況進行測定，對厭氧性的菌、營養(yǎng)要求高的菌如肺炎球菌、腦膜炎球菌等顯然不能使用此法。試管法、平板法、管碟法抑菌效果有差異，試管法因為中藥顏色深，最不準(zhǔn)確;平板法不能最大限度提高中藥濃度，對于高MIC中藥測定不利;管碟法結(jié)合了試管法濃度高、準(zhǔn)確和平板法顯示穩(wěn)定的優(yōu)點，比較適合中藥MIC的測定。

刃天青微孔板顯色法利用活細胞線粒體酶可以將藍色的刃天青還原為粉紅色的的原理，測定細胞的代謝活性及增殖反應(yīng)，刃天青顯色法以其簡便、快速、靈敏等優(yōu)點，愈來愈多地應(yīng)用于檢測各種細菌對化學(xué)藥物的敏感性［5］，是以上方法中較為理想的一種方法。

［1］聞平，陳蕾.胡桃楸提取物對白念珠菌生長的抑制作用.中國微生態(tài)學(xué)雜志，2005，17(5)：335-338.

［2］NCCLS/CLIS.Perfrom ance Standards for Antimicrobial Susceptibility testing，fifteenth informational supplement M 100-S15，125(1):44-52.

［3］楊致邦.引起醫(yī)院內(nèi)感染暴發(fā)流行的馬紅球菌的生物學(xué)特征.中國人獸共患病雜志，1997，12(3):17-19.

［4］村中幸二.尿の定量的細菌檢查法.臨床檢驗，1996，30:587.

［5］Sarker SD，Nahar L，Kumarasamy Y.Microtitre plate-based antibacterial assay incorporating resazurin as an indicator of cell growth，and its application in the in vitro antibacterial screening of phytochemicals.Methods，2007，42:321-4.

(2011-10-11收稿)