泛素化在人表皮生長因子受體降解中的研究進展

李 燾綜述，劉朝奇，王雄偉審校

（三峽大學:1.神經病學研究所；2.分子生物研究所，湖北 宜昌 443003）

人類表皮生長因子受體（EGFR）是原癌基因c－erBb－1的表達產物，其編碼的蛋白質屬Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶生長因子受體，由3部分組成:胞外區、跨膜區和膜內區，包括EGFR、C－erbB－2、C－erbB－3、C－erbB－44個成員，EGFR 與配體結合而激活后，胞內區的酪氨酸殘基自磷酸化轉為活性形式，誘發下游信號傳導途徑（如 PLC－γ、Ras、PI3K、JAK2），引起級聯反應，促進腫瘤的發生、增殖、轉移、放化療抵抗。泛素化介導的EGFR降解是下調其活化的一個常見機制［1］。本文對泛素化在EGFR降解中的研究進展綜述如下。

1 泛素－蛋白酶系統（UPS）

UPS是真核生物中必不可少的結構，它可以控制包括蛋白激酶在內的多種蛋白。泛素是小分子多肽，可以通過ATP依賴途徑激活，泛素與基質蛋白的結合需要3個酶的參與:Ub活化酶（E1）、泛素結合酶（E2）、泛素連接酶（E3）。E1主要活化Ub，E2與活化的Ub作用后通過E3連接酶與酶作用物結合，進而促使了酶作用物的泛素化，E3連接酶HECT結構域和RING結構域2個獨特的類型。具有HECT的E3連接酶與Ub結合形成硫酯鍵，進而將E3連接酶直接轉移到酶作用物，具有RING結構域的E3連接酶不與Ub結合形成硫酯鍵，它主要是作為適配器來促使E2結合酶與酶作用物結合，進而促使泛素與酶作用物的結合［2］。c－Cbl是一個新發現的E3泛素連接酶，可以通過指環結構域與E2泛素結合酶結合，導致底物泛素化和降解。

表皮細胞生長因子（EGF）與受體結合，磷酸化的c－Cbl補充到細胞膜表面，并通過TKB與活化的EGFR的Y1045結合，隨后共定位于核內體和多泡小體中，E2泛素結合酶Ubc4／5與細胞膜上的c－Cbl協同作用，隨后進入Hrs陽性核內體，提示EGFR在內在化后被泛素化［3］。Frey等［4］發現，EGFR的泛素化需要EGFR激酶的活化和Y1045位點的磷酸化，此外，活化的P38也參與了此過程。在人膠質母細胞瘤結構性激活的EGFRvⅢ中，Y1045的突變抑制了Cbl－b介導的EGFRvⅢ的泛素化和信號下調，因此加強了EGFRvⅢ對細胞的轉換能力［5］。

Huang等［6］通過質譜分析法發現，EGF介導了EGFR激酶域中亮氨酸富集序列的泛素化，亮氨酸殘基在激酶域的突變可以阻止EGFR的泛素化和降解，Y1045的突變可以很大程度的減少但并不能消除這些殘基的泛素化，可能與E3連接酶或者非Y1045依賴性的c－Cbl的補充相關。Grb2可以與磷酸化的Y1068或者活化的EGFR的Y1068直接結合，進而通過SH3域與Cbl結合，補充Cbl到EGFR。Shc是具有Grb2的復合體，可以與EGFR中磷酸化的Y1148和Y1173相結合，Cbl也可能直接通過與Shc補充到EGFR［7］。

磷酸化的EGFR能夠被下游通路中的PKC所抑制，PKC介導的T654位點的磷酸化抑制了EGFR的磷酸化、泛素化及降解，使內在化的EGFR循環回到細胞膜［8］。RALT與EGFR的結合可以抑制EGFR活性的下調，而跨膜蛋白LRIG1與EGFR和c－Cbl結合、ACK1與活化的EGFR的相互作用均可以促進 EGFR 活性的下調［7，9］。

EGF還可以激活EGFR的類泛素化修飾，進而加強隨后的泛素化和挑選EGFR進行降解，EGFR的類泛素化修飾與泛素化相互協調，加速了受體降解前的挑選［10］。此外，網格蛋白依賴性和脂筏依賴性內吞作用也參與了EGFR分子的泛素化，EGFR可以通過網格蛋白依賴性內吞作用內在化，然后循環回到細胞表面，與此相反，EGFR通過脂筏依賴性內吞作用內在化后優先進行降解［11］。

2 Cbl對EGFR的調節

Cbl家族中其他兩個成員Cbl－b和Cbl－3也參與促進EGFR降解，活化的EGFR不僅可以降低Cbl－b及其酶作用物Shc和Grb2的降解，促進了Shc和Grb2相互作用，還增強了Shc和Grb2在細胞膜的補充。目前研究認為，有3個蛋白質（Nedd4、Itch及HECTE3連接酶的 WW域）參與了早期的內吞作用的調節，它們可以與Cbl－b結合并促進其在蛋白酶體中的降解，Nedd4可以與Cbl－b結合并促進其在蛋白酶體中的降解，翻轉Cbl－b對EGFR的泛素化和降解作用，并可以激活c－Src，因此提供了另一個對Cbl酶作用物的直接調節的機制［12］。

v－Cbl和70Z－Cbl是c－Cbl的兩個指環結構缺陷的致癌突變體。v－Cbl是具有355個氨基酸的蛋白質，70Z－Cbl是缺乏17個內在氨基酸的突變體，并且這17個內在氨基酸與指環結構存在部分重疊，指環域的突變可以導致E3連接酶的活性消失，但仍然不足以引起細胞的惡性轉化，與此相反，與SH2和指環結構連接的高度保守的α螺旋結構的突變促使了Cbl蛋白的致癌作用，這可能是通過破壞Cbl和Ubc的TKB域導致EGFR的泛素化和下調功能的缺失。Baldys等［13］發現，c－Cbl促進雙調蛋白介導的EGFR循環回細胞膜，并介導了ERK1／2MAPK的磷酸化激活。此外，c－Cbl還可以通過上調 MMp2的水平增加膠質瘤細胞的侵襲性［14］。

3 泛素化與早期內吞作用

SH2結構域和指環結構在EGFR泛素化中扮演重要角色，c－Cbl具有聚脯精氨酸結構的C端與CIN85（85×103長度的c－Cbl相互作用蛋白）N端的SH3域結合，可以補充CIN85－內吞蛋白復合體到活化的EGFR，內吞蛋白通過SH3域與CIN85結合，在早期的內吞作用中調節細胞膜的內陷，c－Cbl與Sprouty2的相互作用可以對EGFR進行調整，Sprouty2與CIN85和c－Cbl構成了一個三位復合體，阻止CIN85介導的c－Cbl的聚集及CIN85對EGFR泛素化的阻斷。Feng等［15］研究發現，Sprouty2通過與c－Cbl共同作用增加EGFR的整體水平及磷酸化水平，進而降低大腸癌細胞對EGFR靶點藥物gefitinib的敏感性。同樣，β－Pix的SH3域與Cdc42形成復合體，然后和CIN85一起與c－Cbl的脯氨酸精氨酸富集區結合，進而抑制c－Cbl對EGFR負性調節功能，反之，c－Cbl促進β－Pix的泛素化及降解［16－17］，此外，與CIN85相互作用的凋亡關聯蛋白ALG－2相關蛋白X（Alix）和具有UBA和SH3結構的T細胞Ub配體（TULA）通過與CIN85或者c－Cbl結合抑制EGFR泛素化［18］。Wakasaki等［19］發現，CIN85可以促進 TGF－α介導的RAS及下游通路的激活，進而促進HNSCC腫瘤細胞的增殖，而不影響EGFR的磷酸化水平。

Hrs和信號轉換銜接分子（STAM）是EGFR內吞作用的調節因子，具有UIM域，Hrs與STAM共同作用并共同定位于早期核內體膜表面。Hrs－STAM復合體可以通過識別活化的EGFR的Ub挑選受體，并促使挑選的受體從早期的核內體進入多泡小體中（MVB）。EGF激活作用上調后，Hrs的Y329和Y334位點以Cbl E3連接酶依賴性的方式出現磷酸化，促進Hrs和EGFR的降解，Hrs或者STAM的刪除或者缺陷的哺乳動物細胞抑制EGFR的降解［18］。去泛素化酶USP8與Hrs的作用相反，可以通過與STAM結合而減慢去泛素化過程，使得EGFR的降解減少［20］，而機體維持Hrs與USP8平衡的機制尚不清楚，可能與腫瘤細胞所處的微環境有關。

4 泛素化與晚期內吞作用

目前仍不完全清楚機體是通過何種機制精確調節EGFR的降解而不是回到細胞膜，研究認為泛素與轉運必需內吞體分選復合物（ESCRT）的相互作用在MVB的挑選過程中發揮重要作用。

在酵母菌中，ESCRT－Ⅰ基因由Vps23、Vps 28及Vps37組成，Vps23是哺乳動物易感基因Tsg101的同源體，ESCRT－1編碼產生一段350×103長的保守蛋白復合體，可以短暫地從胞漿補充到核內體膜上［1］，ESCRT－Ⅱ是由 Vps22、Vps25以及Vps36組成的復合體，編碼產生155×103的蛋白，ESCRT－Ⅲ是由2個功能性子復體構成:一個由Snf7／CHMP4a和Vps20／CHMP6構成的近膜子復體，另一個由Vps2／CHMP2a和Vps24／／CHMP3構成的外圍關聯子復體，ESCRT－Ⅲ易位到核內體的過程依賴于ESCRT－Ⅱ的參與［21］。

泛素化的EGFR被挑選進入MVB首先由HRS（Hrs蛋白調控酪氨酸激酶ESCRT－0）觸發，HRS可以通過串聯泛素結合模體（UIM）與泛素化的EGFR結合，進而通過FYVE域與3磷酸磷脂酰肌醇結合后定位到核內體膜。隨后HRS通過PSAP序列域召集ESCRT－1到核內體膜上的著錨點，ESCRT－Ⅰ可以通過其組件中的TSG101中的UEV域識別泛素化的EGFR，ESCRT－Ⅱ可以通過其Vps36的Np14鋅指結構（NZF）識別泛素化的EGFR，EGFR隨后通過ESCRT－Ⅲ復合體聚集，泛素則通過去泛素化酶DOA4移除，聚集的EGFR被挑選進入MVB的囊泡中，ESCRT復合體通過ATP酶相關活性蛋白Vps4分離出來［22－23］。包括HIV在內的多種病毒具有泛素化的GAG蛋白，可以與TSG101結合，進而補充ESCRT到細胞膜表面，以及在MVB中通過同樣的方式引起病毒顆粒的出胞作用［24－25］。此外，AMSH、AMSH 結構樣蛋白及其他的泛素分解酶（DUB）比如泛素特異蛋白酶8（DOA4的直系同源體），能夠在泛素化的EGFR進入MVB之前將Ub殘基分離，從而促使Ub循環回到細胞質［18，26］。目前仍不清楚DUB在內吞作用中不同階段協同EGFR去泛素化的機制。

5 ErbB2、ErbB3、ErbB4與泛素化的關系

ErbB2的高表達與腫瘤的預后不良呈正相關。EGF、神經調節蛋白和ErbB2特異性抑制性抗體都可以介導ErbB2的泛素化和降解，這些抗體與ErbB2結合后補充c－Cbl到ErbB2的Y1112位。Y1112的突變可以阻礙抗體介導的ErbB2的降解［27］。c－Cbl參與配體介導的EGFR家族蛋白的降解，這個過程需要EGFR蛋白的C端激酶活化和酪氨酸磷酸化，在配體依賴性機制中，只有受體所在部位的細胞膜被作為靶點，而ErbB2烷基化主要作用在位于EGFR核酸連接部位的半胱氨酸殘基［18］。ErbB2和Hsp90抑制劑可以調節UPS介導的早期的和成熟的ErbB2的降解，E3連接酶和CHIP也有可能參與調節這個過程［28］。此外，具有指環結構域的Nrdp1可以激活ErbB3的泛素化和降解，Itch的過度表達可以通過 WW域與ErbB4受體結合，進而促進其聚泛素化和降解，但是不能與EGFR、ErbB－2及 ErbB－3作用［18］。

6 展 望

EGFR的過度表達與腫瘤的發生、侵襲性、耐藥性及放療耐受相關，泛素化介導的EGFR降解是下調其活化的一個常見機制，泛素介導EGFR在細胞內的降解機制尚不完全清楚，相信這些問題的解決將有利于理解泛素化與EGFR相關性腫瘤發生發展中的關系，進而解釋泛素化在腫瘤研究中的前景。

［1］Katzmann DJ，Odorizzi G，Emr SD.Receptor downregulation and multivesicular－body sorting［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2002，3（12）:893－905.

［2］Sun Y.Targeting E3ubiquitin ligases for cancer therapy［J］.Cancer Biol Ther，2003，2（6）:623－629.

［3］Umebayashi K，Stenmark H，Yoshimori T.Ubc4／5and c－Cbl continue to ubiquitinate EGF receptor after internalization to facilitate polyubiquitination and degradation［J］.Mol Biol Cell，2008，19（8）:3454－3462.

［4］Frey MR，Dise RS，Edelblum KL，et al.p38kinase regulates epidermal growth factor receptor downregulation and cellular migration［J］.EMBO J，2006，25（24）:5683－5692.

［5］Davies GC，Ryan PE，Rahman L，et al.EGFRvIII undergoes activation－dependent downregulation mediated by the Cbl proteins［J］.Oncogene，2006，25（49）:6497－6509.

［6］Huang F，Kirkpatrick D，Jiang X，et al.Differential regulation of EGF receptor internalization and degradation by multiubiquitination within the kinase domain［J］.Mol Cell，2006，21（6）:737－748.

［7］Swaminathan G，Tsygankov AY.The Cbl family proteins:ring leaders in regulation of cell signaling［J］.J Cell Physiol，2006，209（1）:21－43.

［8］Thiel KW，Carpenter G.Epidermal growth factor receptor juxtamembrane region regulates allosteric tyrosine kinase activation［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（49）:19238－19243.

［9］Shen F，Lin Q，Gu Y，et al.Activated Cdc42－associated kinase 1is a component of EGF receptor signaling complex and regulates EGF receptor degradation［J］.Mol Biol Cell，2007，18（3）:732－742.

［10］Oved S，Mosesson Y，Zwang Y，et al.Conjugation to Nedd8instigates ubiquitylation and down－regulation of activated receptor tyrosine kinases［J］.J Biol Chem，2006，281（31）:21640－21651.

［11］Sigismund S，Argenzio E，Tosoni D，et al.Clathrin－mediated internalization is essential for sustained EGFR signaling but dispensable for degradation［J］.Dev Cell，2008，15（2）:209－219.

［12］Balbis A，Parmar A，Wang Y，et al.Compartmentalization of signaling－competent epidermal growth factor receptors in endosomes［J］.Endocrinology，2007，148（6）:2944－2954.

［13］Baldys A，G?oz M，Morinelli TA，et al.Essential role of c－Cbl in amphiregulin－induced recycling and signaling of the endogenous epidermal growth factor receptor［J］.Biochemistry，2009，48（7）:1462－1473.

［14］Lee H，Tsygankov AY.c－Cbl regulates glioma invasion through matrix metalloproteinase 2［J］.J Cell Biochem，2010，111（5）:1169－1178.

［15］Feng YH，Tsao CJ，Wu CL，et al.Sprouty2protein enhances the response to gefitinib through epidermal growth factor receptor in colon cancer cells［J］.Cancer Sci，2010，101（9）:2033－2038.

［16］Swaminathan G，Tsygankov AY.The Cbl family proteins:ring leaders in regulation of cell signaling［J］.J Cell Physiol，2006，209（1）:21－43.

［17］Schmidt MH，Husnjak K，Szymkiewicz I，et al.Cbl escapes Cdc42－mediated inhibition by downregulation of the adaptor moleculeβPix［J］.Oncogene，2006，25（21）:3071－3078.

［18］Sorkin A.Goh LK.Endocytosis and intracellular trafficking of ErbBs［J］.Exp Cell Res，2008，314（17）:3093－3106.

［19］Wakasaki T，Masuda M，Niiro H，et al.A critical role of c－Cbl－interacting protein of 85kDa in the development and progression of head and neck squamous cell carcinomas through the ras－ERK pathway［J］.Neoplasia，2010，12（10）:789－796.

［20］Berlin I，Schwartz H，Nash PD.Regulation of epidermal growth factor receptor ubiquitination and trafficking by the USP8·STAM complex［J］.J Biol Chem，2010，285（45）:34909－349021.

［21］Babst M，Katzmann DJ，Estepa－Sabal EJ，et al.Escrt－III:an endosome－associated heterooligomeric protein complex required for mvb sorting［J］.Dev Cell，2002，3（2）:271－282.

［22］Hurley JH.ESCRT complexes and the biogenesis of multivesicular bodies［J］.Curr Opin Cell Biol，2008，20（1）:4－11.

［23］Williams RL，Urbe S.The emerging shape of the ESCRT machinery［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8（5）:355－368.

［24］Patton GS，Morris SA，Chung W，et al.Identification of domains in gag important for prototypic foamy virus egress［J］.J Virol，2005，79（10）:6392－6399.

［25］Luttge BG，Shehu－Xhilaga M，Demirov DG，et al.Molecular Characterization of feline immunodeficiency virus budding［J］.J Virol，2007，82（5）:2106－2119.

［26］Kirisits A，Pils D，Krainer M.Epidermal growth factor receptor degradation:an alternative view of oncogenic pathways［J］.Int J Biochem Cell Biol，2007，39（12）:2173－2182.

［27］Klapper LN，Waterman H，Sela M，et al.Tumor－inhibito－ry antibodies to HER－2／ErbB－2may act by recruiting c－Cbl and enhancing ubiquitination of HER－2［J］.Cancer Res，2000，60（13）:3384－3388.

［28］Xu W，Marcu M，Yuan X，et al.Chaperone－dependent E3 ubiquitin ligase CHIP mediates a degradative pathway for c－ErbB2／Neu［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（20）:12847－12852.