根霉菌反應分離耦合生產有機酸的研究進展

陸君潔 ，萬永軍 ，付永前 ★

（1.臺州學院 生命科學學院，浙江 臺州 318000 2.臺州金晟環保制品有限公司，浙江 仙居 317300）

0 引言

生物反應/分離耦合過程（Integrated Bioreaction-Seperation Process），被 A.Freeman［1］稱為原位產物分離過程（In Situ Product Removal，簡稱ISPR），是興起于二十世紀六十年代末的一項正在迅速發展的新技術，是指在生物反應發生的同時，選擇一種合適的分離方法及時地將對生物反應有抑制或毒害作用的產物或副產物選擇性地從生產性細胞或生物催化劑周圍原位移走。其優點突出表現在：①、在線分離出發酵產物可解除生物反應過程中普遍存在的產物抑制，提高反應速率；②、簡化產物分離過程的投資和操作費用；③、易于實現生產全過程的連續化和自動化。

根霉菌（Rhizopus species）具有發酵產物光學純度高、產酸能力強、營養要求簡單、產物容易提純等優點而被廣泛應用于L-乳酸和富馬酸的發酵生產中［2-4］。根霉菌并不是一種能耐受高酸度的微生物，因此在有機酸的發酵過程中進行有效的pH控制就顯得非常重要。較常用的pH控制方法是添加堿性物質如各種碳酸鹽、碳酸氫鹽、氫氧化物及氨水等，其中CaCO3是最常用的中和試劑。然而，使用CaCO3作中和試劑存在提取工藝流程長、消耗工業原料多以及回收率低，同時還會產生大量的廢渣（CaSO4）和廢水，環保壓力較大，能耗高［5］。針對上述問題，科研工作者研究使用其他中和試劑來替代CaCO3，如Na2CO3、NaHCO3、Ca（OH）2、（NH4）2CO3以及 KOH 與 K2CO3的混合物等［6］，但采用這些中和劑時，有機酸的產量以及生產強度均比使用CaCO3做中和試劑時要低，其原因主要是可溶性的有機酸鹽隨著發酵的進行會表現出很強的抑制效應，嚴重阻礙了菌體的生長和產物的進一步生成［7］。基于以上原因，以反應/分離耦合過程為技術平臺發酵生產包括富馬酸、乳酸等在內的各種重要有機酸勢必會成為日后有機酸生產行業研究的重點。

1 反應/分離耦合技術的概述

有機酸的發酵生產乃至其它生物化工過程中普遍存在著生產效率低、回收成本高等問題，經濟可行性成為這些生物化工過程應用和進一步推廣的主要障礙。其主要原因在于許多生物反應都存在著嚴重的產物抑制，造成生物反應過程的反應速率低、底物利用率低及反應體系中最終產物濃度低，加大了產品分離的難度和分離過程的投資和操作費用。可見，提高生產效率、降低回收成本的關鍵在于消除生物反應過程中存在的產物抑制，而解決的辦法之一就是將生物反應與分離過程更加緊密而有機的結合，在生物反應進行的同時從反應體系中及時分離出抑制產物，正是基于這一思想，生物反應與分離耦合過程的研究方興未艾，成為生物化工研究的熱點之一［8］。

生物反應與分離耦合過程的研究最早興起于六十年代末，當時的研究大多數是針對可揮發性初級代謝產物的生產體系，其中主要采用基于產物揮發性的分離方法如真空蒸發、氣提等，進行產物的在線分離［9］，但這類產物的生產并不能充分體現耦合過程的優越性，同時這些工藝本身由于存在諸多缺陷而至今難以實現在工業生產上的推廣與應用；進入八十年代以來，研究重心逐漸轉移到非揮發性初級代謝產物的耦合過程上，在這一時期，耦合過程的工藝日趨成熟，形式也更趨多樣化，相對于原位耦合過程而言，異位耦合過程引起了更大的重視；進入九十年代以后，發酵與分離耦合技術的應用面更趨廣泛，分離手段更多，工藝更先進，應用體系已擴大到包括微生物次級代謝產物和蛋白質的發酵生產，動植物細胞培養等［10］。九十年代初期，根霉菌利用該技術發酵生產有機酸的研究開始引起研究者的關注，在將近20年的研究歷程中，逐漸開發了基于萃取、膜分離、吸附等分離手段的根霉菌生產有機酸的反應分離耦合工藝。

2 根霉菌反應/分離耦合制備有機酸工藝的研究

根霉菌是一類典型的絲狀真菌，傳統的根霉菌發酵生產有機酸，多利用游離的米根霉菌絲在生物反應器中進行發酵，根霉菌的菌絲發達，在反應器中易形成大的菌絲團，引起氧氣及其它營養物質的傳遞困難，或纏繞在攪拌槳上，使攪拌阻力增加，使得產物生成速率低、得率低、生產不穩定，因此，根霉菌的反應分離耦合體系一般較為復雜，要實現反應分離耦合技術在根霉菌生產有機酸的工業化應用，須從以下三個關鍵技術進行優化與集成：①、適于耦合體系根霉菌的固定化技術；②、適于耦合體系根霉菌發酵的生物反應器的研究；③、適于耦合體系的分離技術。

2.1 根霉菌固定化技術的研究

所謂固定化技術就是將生物催化劑限制在一定的空間范圍內并保持所需的生物催化活性。細胞固定化方法有很多，Karel等將其歸納為四大類：表面附著、多孔介質包埋、隔離和自聚集。而使用根霉菌固定化主要集中于載體固定化［11］（凝膠包埋法、吸附法）和無載體自固定化（自聚集）技術的研究。

2.1.1 載體固定化

載體固定化技術即是將根霉菌菌體固定在不同載體材料上，在選用載體材料時，研究者大多數開始使用軟凝膠，如海藻酸鈣等。然而，根霉菌在固定化顆粒內部的分布并不像細菌和酵母那樣均勻，同時，海藻酸鈣在生產過程中，存在凝膠顆粒易發生破損、軟化等問題，使得凝膠顆粒的穩定性和機械強度相對較差，不利于固定化細胞的多次利用；鑒于海藻酸鈣的不足，有的學者使用對根霉菌具有吸附性的載體進行菌體固定化技術的研究。如Sun等［12］應用該技術固定化根霉菌在氣升式反應器發酵與離子交換樹脂分離生產乳酸，并建立了耦合模型。載體固定化所用載體范圍很廣，從天然惰性材料如粘土、氧化鋁等，到人工合成的樹脂、多層纖維、尼龍等網狀織物，甚至一些天然生物質材料如各種植物的種子、玉米棒芯、蔗渣等。雖然用于米根霉固定化發酵生產有機酸的載體種類相對比較多，但是很少能優化出用于大規模生產并創造出良好的經濟效益的載體規格，同時載體材料的使用隨之帶來了許多細胞生理、生態、工藝、工程和經濟方面的問題，因此載體固定化米根霉發酵生產有機酸技術較難實現于大規模的工業化應用。

2.1.2 自固定化技術

自固定化技術是指利用某些具有較強自身絮凝能力的菌株形成顆粒，以此作為一種固定化細胞的方法。根霉菌具有較強的自吸附能力，在發酵液中能形成多種不同的菌體形態（球狀、絮狀及團塊狀等），其中球狀菌體因其在傳質傳氧、產物分離及重復利用等方面的優勢而成為根霉菌發酵產有機酸的首選。如：Fu等［13］成功實現了攪拌式反應器的逐級放大米根霉菌球形態控制工藝，可使菌絲體形成直徑約1.2mm的小球。然而，目前鮮有利用自固定化根霉菌細胞反應分離耦合制備有機酸的文獻報導，其主要是因為影響菌體生長形態的因素很多，包括：培養基組成、初始pH、接種物、培養溫度、發酵罐形狀、攪拌供氣系統、培養方式、發酵液粘度等。如何穩定地獲得形態均一、大小合適、活力強勁的自固定化細胞仍是當前需要攻克的技術難題。另外，由于種子培養過程的可分析參數較少，種子的內在質量難于控制，多是根據發酵的最終結果來判斷，相對于發酵過程的研究而言，針對種子培養的系統優化還有待于進一步的研究。但是，自固定化根霉菌技術的實現，將有效解決絲狀真菌發酵過程中形態控制難的問題，提高發酵過程的傳質、傳氧及傳熱效率，降低產物分離難度，強化生產強度，減少生產成本。

2.2 生物反應器的研究

利用生物催化劑進行反應的生物反應器，在生物過程中為細胞代謝提供了一個適宜的物理及化學環境，促使細胞更好生長，并得到更多的生物量或代謝產物，是實現生物技術產品工業化的關鍵設備。固定化細胞生物反應器大致可以分為嫌氣型和通風型兩大類［14］，嫌氣型的有固定床、流化床、中空纖維膜反應器等，通風型的有攪拌式、氣升式、轉盤式等［15］。根據根霉菌好氧發酵的特點，研究者采用的生物反應器多采用通風型的氣升式、轉盤式和攪拌式等。

氣升式生物反應器則以其結構簡單、剪切力小、營養物質混合均勻、氧氣供應充足而在根霉菌固定化發酵中顯示出極大的優越性，據不完全統計，近70%的研究者都選用這種型式。但是該方式剪切力小、養料供應充足易造成固定化菌絲及游離菌絲的過度生長，以至充滿整個發酵罐而使操作被迫停止；轉盤式生物反應器已廣泛應用于污水處理中，是生物膜法處理污水的重要裝置之一。該固定化方法的特點是能使固定化菌體間歇的在空氣和培養基之間轉換。這種固定化的生物被膜可以重復利用兩周以上而沒有活力損失［16］，但該反應器在大規模的工業應用中有限制；攪拌罐因其攪拌漿產生的剪切力過大而使固定化菌絲易脫落，且游離菌絲易纏繞到攪拌漿上造成攪拌阻力增大，故不易適用于根霉菌的固定化發酵。但攪拌式發酵罐是目前生物發酵工業化生產最常用的反應器，少數研究者也在研究改進固定化材料的機械強度以及攪拌罐的結構，使其在霉菌固定化中使用。近年來，根霉菌自固定化技術不斷取得突破，使得根霉菌利用攪拌式發酵罐生產有機酸成為可能，Fu等［17］在攪拌式發酵罐中研究了雙階段溶氧策略調控米根霉菌球發酵生產富馬酸，富馬酸轉化率達到了54.2%。有理由相信，結合自固定化根霉菌在攪拌式發酵罐中工業化生產有機酸具有巨大的潛力。

2.3 分離技術研究

分離過程在生物化學工程中的重要性無論是技術上，還是經濟上都要大大高于傳統的化學工程。因此，發展和改進生物分離過程本身對整個生物化學工程的發展占有舉足輕重的地位。而生物分離過程只有有效地與生物反應過程相配合、相協調，才能充分體現出其特色與先進性。目前在生物反應與分離耦合過程中常用的分離方法有：1）基于產物揮發性的方法；2）萃取法；3）膜分離法；4）固態化產物分離法。在乳酸、富馬酸發酵與分離耦合過程中，由于這兩種有機酸沸點較高且高溫下易分解，因而不宜采用基于產物揮發性的方法，可應用的方法主要有：有機溶劑萃取法、膜分離法以及離子交換法。

有機溶劑萃取法是提取化工產品的重要方法，但是該方法存在著產物選擇性差、對菌體有毒害等弊端，因此該技術的研究還主要集中于發酵結束后產物的提取，目前萃取有機酸所選用的萃取劑主要包括Alamine 336、Amberlite LA-2、三丙胺（TPO）+TOA，三辛胺（TOA）等。膜分離法是一門新興的跨學科技術，有機酸提取工藝中研究較多的是電滲析法分離。然而，電滲析法提取有機酸存在膜易污染、生產成本高等問題，因此，以后的研究重心應放在降低儀器成本以及耦合體系如何高效耦合等問題上。離子交換樹脂具有吸附容量大，吸附選擇性強，易于工業化等特點，因此，在有機酸提取中倍受青睞。利用離子交換樹脂對有機酸進行分離純化的工藝已較為成熟，并已經實現了工業化的應用。進入二十世紀九十年代，針對有機酸反應分離耦合體系的離子交換分離工藝的研究也越來越引起人們的興趣。如Fu等［18］以根霉菌反應分離耦合生產富馬酸體系為研究對象，考察了樹脂Amberlite IRA-400對富馬酸的動態吸附，并得到了最優的吸附條件；同時考慮到發酵過程中葡萄糖對有機酸吸附的影響，付永前等［17］進一步深入研究了從葡萄糖-富馬酸溶液中提取富馬酸的離子交換工藝，并從6款堿性離子交換樹脂篩選了一款樹脂Amberlite IRA-400，最大吸附量為122mg/g，對葡萄糖吸附較少，利用該樹脂參與富馬酸的發酵，可以連續將發酵液中的富馬酸分離出來，從而維持發酵所需的pH值，而葡萄糖則返回發酵罐繼續參與發酵，從而能實現富馬酸的連續發酵。

2.4 根霉菌反應分離耦合生產有機酸耦合工藝的研究

根霉菌反應分離耦合生產有機酸工藝就是將以上三個關鍵技術進行集成與優化。對現有耦合工藝進行總結發現，目前，耦合過程中根霉菌的固定化還主要采用載體固定化技術，反應器也多集中于膜轉盤式反應器，分離技術采用了有機溶劑萃取、電滲析與離子交換技術。雖然該工藝路線報導較少，但利用該工藝生產有機酸，有機酸的生產強度顯著提高。

3 小結與展望

近二十年來，利用根霉菌合成L-乳酸和富馬酸的研究已經取得了較大的進展，乳酸以及富馬酸的發酵水平成倍增長，但進入二十一世紀以來，有機酸的生產卻面臨著發酵水平有限，生產成本高；存在環境污染，同時物耗、能耗較大兩大瓶頸問題。綜合耦合體系中各個技術的研究現狀，筆者建議今后耦合體系應從以下幾個方面入手進一步開展研究工作，以解決耦合工藝中存在的問題，實現根霉菌發酵分離耦合生產有機酸的工業化生產：1）適于耦合體系根霉菌自固定化技術的研究；2）適于耦合體系的生物反應器的研究；3）適于耦合體系的分離工藝的研究；4）耦合體系集成的研究。

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