代謝組學在轉運蛋白的生物體內功能分析中的應用

金井好克，何 新

（1.日本；2.天津中醫(yī)藥大學，天津 300193）

轉運蛋白是一種參與小分子化合物跨細胞膜轉運的膜蛋白，對體內物質分布起著決定性作用，當轉運蛋白的表達量和功能出現(xiàn)變化或異常時都會引起體內物質分布的改變。代謝組學的興起和發(fā)展使生物體內轉運蛋白功能的認知成為可能。代謝組學能夠解析孤兒轉運蛋白的功能，使轉運蛋白的新功能與疾病的關聯(lián)性得以闡釋。代謝組學必將為后基因組研究帶來重大突破。

20世紀90年代分子克隆研究的重大進展推進了轉運蛋白分子結構的解析。轉運蛋白分為ABC轉運蛋白和SLC轉運蛋白兩大類。ABC轉運蛋白因具有特征性的ATP Binding cassette而得名，其能夠水解ATP，實現(xiàn)有機物的主動轉運。除ABC轉運蛋白之外（即不含ATP Binding cassette）的轉運蛋白統(tǒng)稱為SLC轉運蛋白，截止目前已劃分為51個家族、包括378個成員分子，其中多數(shù)孤兒轉運蛋白的功能尚未確定，雖然體外研究中發(fā)現(xiàn)某種機制，但其在生物體內的機制仍不明確。確定轉運蛋白在生物體內的功能已成為后基因組時代研究轉運蛋白分子評價的重要終極目標之一，分子克隆解析為達成此目標提供了頗具意義的重要信息。

1 以往轉運蛋白研究中存在的問題

如前所述，目前轉運蛋白的分子組成已基本明確，未來的研究方向是轉運蛋白的功能以何種結構為基礎實現(xiàn)、以及轉運蛋白如何在生物體內發(fā)揮作用。對于前者，結構生物學可以給出答案，但對于后者，生物體內真實底物的鑒定與轉運蛋白功能的定量測定技術是必不可少的。將純化后的cDNA導入至非洲爪蛙卵母細胞或哺乳動物細胞的基因表達系統(tǒng)中，根據(jù)放射性標記的底物攝取情況分析分子克隆后的轉運蛋白功能。這種體外分析過程依賴于研究者選擇的理想底物，難以排除人為的隨意性。這種研究模式不能闡明特定轉運蛋白的最適底物，也無從確定在生物體內轉運的究竟是不是這個底物。要脫離現(xiàn)今這種“猜謎”式研究模式，必須正確表達轉運蛋白在生物體內的實際功能，并采用詳盡的分析方法。代謝組學能夠全面定量探測化合物的變化，使轉運蛋白的在體研究成為可能。

2 代謝組學用于轉運蛋白研究的實例

為了建立生物體內轉運蛋白功能的代謝組學研究方法，簡單而言，首先要使特定轉運蛋白的表達發(fā)生大幅度變化，檢測由此造成的代謝組學變化，再討論轉運蛋白功能與代謝組學的相關性。現(xiàn)代轉運蛋白功能分析中一般采用基因敲除小鼠，將其代謝組與野生型小鼠相比較，結果清晰易得。也可采用基因過表達小鼠或大鼠，已有相關成功案例的報道。目前代謝組學正處于轉運蛋白研究的初級階段，轉運蛋白的活性可以直接體現(xiàn)出來，比如腎小管轉運蛋白基因敲除小鼠的尿檢簡單易行，也可檢測轉運蛋白基因敲除小鼠或轉基因大鼠血液或組織中的成分變化。

代謝組學用于轉運蛋白研究的另一個決定性理由是代謝組學定量性良好，特別是對于小鼠尿液等微量樣品也能以高靈敏度的方法進行測定。毛細管電泳與質譜聯(lián)用（CE-MS）法可用于微量樣品的定量分析，可以預見這種聯(lián)用技術將為轉運蛋白的研究再次帶來重大突破。由于代謝組學研究綜合全面性的特點，與體外功能分析研究結果相比可能會獲得一些意想不到的信息。

筆者鑒定SLC 22家族孤兒轉運蛋白的功能時采用了CE-MS代謝組學的方法。有機酸轉運蛋白家族的底物極為多樣，轉運底物多難猜測，因此多數(shù)轉運蛋白功能不明。SLC 22家族包括多個有機酸轉運蛋白，其中一部分與已知功能基因表達的轉運蛋白不同。筆者以其中之一的OATN1為研究對象，考察其組織分布，發(fā)現(xiàn)OATN1為腎臟獨有的轉運蛋白，存在于近曲小管的管腔側膜中，但基因敲除小鼠的表現(xiàn)型不明顯，未找到特定功能的分析線索。

OATN1轉運蛋白存在于腎小管管腔側膜中，與尿液直接接觸，因此其功能的改變應該能夠通過尿液成分的變化表現(xiàn)出來，于是筆者以CE-MS法全面分析比較了基因敲除小鼠與野生型小鼠的尿液成分。CE-MS法可分析測定小鼠尿液（每次強制排尿50 μL左右）等微量樣品，以帶電荷的化合物為檢測對象，因此適于分析轉運蛋白的底物。以CE-MS法分析測定OATN1基因敲除小鼠的尿液，與野生型小鼠相比，檢出71個有差別的峰。以飛行時間質譜儀（TOFMS）測定每個峰的精確分子量，解析出每個峰對應的化合物的示性式，再根據(jù)MS/MS解離結果推測示性式的結構，結構中有多個同分異構體時，推測生物體內可能存在的異構體，購買已知化合物作為對照品，確認購得化合物的峰與目標峰是否能夠重合，如果重合則解析成功。按上述過程進行解析，71個峰中的17個峰成功解析。這些化合物中除了OATN1的原本底物之外，也包括OATN1基因敲除小鼠的次生變化產物，需要進一步將兩者區(qū)分，因此筆者又進行了抑制實驗。培養(yǎng)穩(wěn)定表達OATN1基因細胞，采用已知的OATN1底物14C標記的βhydroxybutyrate，建立OATN1穩(wěn)定表達細胞攝取實驗系統(tǒng)，觀察17個已解析的化合物能否抑制OATN1介導的14Cβ-hydroxybutyrate的攝取。結果顯示，17個化合物中有8個化合物強烈抑制OATN1介導的14C β-hydroxybutyrate的攝取，4個化合物的抑制作用較弱，5個化合物完全沒有抑制作用。抑制標記物轉運的化合物很可能是轉運蛋白直接作用的化合物，不抑制標記物轉動的化合物可能是轉運蛋白基因敲除小鼠次生變化產生的化合物，不屬于轉運蛋白的底物。按上述方法鎖定了12個底物候選化合物，又考察了OATN1穩(wěn)定表達細胞對2個放射標記物（β-hydroxybutyrate和乳酸）的攝取，發(fā)現(xiàn)OATN1對兩者有顯著攝取作用。如上所述，通過代謝組學闡明了未知轉運蛋白的功能。其他沒有放射標記的10個化合物是底物的潛在候選物。OATN1屬于SLC 22家族，一般來說SLC 22家族轉運蛋白的底物選擇范圍較寬，通過上述研究可推測OATN1在生物體內攜帶轉運多個底物。

β-hydroxybutyrate是代謝組學確定的底物之一，屬于酮體，因此明確了OATN1對體內酮體的轉運功能。當饑餓或糖尿病發(fā)作時，細胞不能充分利用葡萄糖，酮體轉化為乙酰輔酶A，參與三羥酸循環(huán)（TCA）。脂肪酸在肝臟中經β-酸化生成酮體，釋放入血液。酮體作為重要能量源，經腎小球濾過進入原尿，再經腎小管重吸收保留在體內，OATN1可能在其中發(fā)揮了重要作用。糖尿病患者酮體濃度大幅升高，造成血液pH下降(糖尿病酮癥酸中毒)，引起全身狀態(tài)惡化，因此可以轉運蛋白為分子靶點，通過抑制該轉運蛋白使酮體從尿中排出，防止血液pH值降低。

3 結語

轉運蛋白決定著體內小分子化合物的分布，抑制其活性可糾正疾病造成的體內物質失衡，成為治療疾病的分子靶點。實際上，抗抑郁藥、利尿藥、降血脂藥等已包含了轉運蛋白抑制劑。葡萄糖轉運蛋白負責腎小管的葡萄糖重吸收，最近葡萄糖轉運蛋白抑制劑作為糖尿病治療藥正處于臨床研究中。中藥中含有多種作用于轉運蛋白的化學成分，代謝組學完全適用于評價這些成分的藥效。通過研究服用中藥后代謝組學的變化，從中預測與之相關的轉運蛋白，分析數(shù)據(jù)建立與轉運蛋白直接相關的實驗方案。代謝組學分析是轉運蛋白研究的有力工具，轉運蛋白決定著體內小分子化合物的分布，代謝組學技術全方位定量測定小分子化合物的變化，精確呈現(xiàn)轉運蛋白介導的物質分布。不論是否作用于轉運蛋白，服用中藥后代謝組學變化也為中藥藥效自身的闡釋提供了極為有益的參考，此領域的未來發(fā)展令人期待。