RNA 干擾抑制NgR 表達對腦梗死大鼠皮質脊髓束可塑性的影響

張小喬 李 鸝 陳 敏 霍江濤 潘慶敏 嚴 潔

與其他中樞神經系統（central nervous system，CNS）損傷性疾病一樣，缺血性腦卒中后中樞神經難以再生是導致偏癱等嚴重后遺癥的主要原因，如何促進損傷神經的再生修復一直是神經科學研究的熱點和難點。目前的研究表明，造成CNS損傷后缺乏再生能力的主要原因是CNS神經元所生存的外部微環境中存在的髓磷脂相關抑制物的作用。現已確認的中樞神經髓鞘來源的主要抑制因子有以下三種：Nogo－A、髓磷脂相關糖蛋白（MAG）和少突膠質細胞髓磷脂糖蛋白（OMgp），三者在CNS中分別由少突膠質細胞和一些神經元產生，存在于髓鞘的內外環和少突膠質細胞的表面，它們具有誘導生長錐塌陷和抑制軸突生長的功能，它們被證實與相同的神經元受體NgR 結合而介導軸突再生抑制作用［1］。作為三個結構不同的軸突生長抑制分子的共同受體，NgR 是提高CNS再生能力治療研究方面的重要突破口。本實驗研究擬在制備缺血性腦梗死大鼠模型的基礎上選擇NgR 基因作為治療的靶點，利用RNA 干擾（RNA interference，RNAi）技術下調NgR 基因的表達，觀察其對腦梗死大鼠神經功能恢復及皮質脊髓束可塑性的影響，為腦缺血后神經再生探索一種基于RNA 的藥物治療新途徑。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

質粒pGenesil（武漢晶賽生物技術有限公司），生物素化葡聚糖胺（Biotinylated dextran amine，BDA）神 經 示 蹤 試 劑 盒（Invitrogen 公 司），兔 抗GAP－43單克隆抗體（1：200稀釋）、山羊抗兔多克隆抗體（1：500稀釋）、兔鏈霉親和素－生物素－過氧化物酶復合物（strept－avidin－biotin complex，SABC）試劑盒（Sigma，USA），兔抗NgR IgG（Santa Cruz，USA），蛋白質marker（Promega 公司），Western blot檢測試劑盒（Amersham 公司）；Olympus光學顯微鏡，HPIAS－1000型彩色計算機圖像分析系統，SPSS16.0統計分析軟件包。

1.2 RNA 干擾質粒的構建

根據Elbashir等的設計原則［2］，應用BLOCK－iTTMRNAi Designer設計軟件設計并選取了兩個分別對應于NgR mRNA（GenBank accession No：NM＿053613）序列上468、1392 起始位點的siRNA作用靶序列（1：GCAGTACCTCTACCTACAAGA；2：GGTACTTTGGACAGTGCTTGG）及一個無 關 序 列（ACGACTGATACTATGGATACA），經BLAST 分析該序列與大鼠其他基因無明顯同源性。化學合成編碼的shRNA 由21bp及BamHⅠ／HindⅢ位點粘末端堿基等組成的寡聚脫氧核糖核酸模板，連接至質粒pGenesil 1中U6啟動子下游BamHⅠ／H indⅢ位點，酶切鑒定后對U6啟動子區和克隆序列區測序（武漢晶賽生物工程技術有限公司）。構建所得兩種RNA 干擾質粒和一種無關對照質粒分別命名為pNgR－shRNA1、pNgR－shRNA2和pCon。用鑒定正確的質粒轉化感受態細菌DH5α，挑取單克隆菌落進行小量擴增提取質粒酶切鑒定正確后再行大量擴增（堿裂解法），硅藻土柱層析法純化，滅菌TE（pH 8.0）溶解后凍存于－20 ℃備用。

1.3 實驗動物分組及干預

Sparague－Dawley健康成年雄性大鼠，由湖北醫藥學院實驗動物中心提供，體重200～250 g，鼠齡12 W，隨機取18只大鼠作為正常對照組，常規飼養至相應時間點取材。其余大鼠在制作局灶性腦梗死模型后隨機分為pNgR－shRNA1 組、pNgR－shRNA2組、pCon 組及模型組，每組各18 只。pNgRshRNA1組、pNgR－shRNA2 組、pCon 組 大 鼠 分 別在腦梗死后當天大鼠蘇醒后于梗死側側腦室注射相應的RNA 干擾質粒（3 mg／kg），模型組不作處理。

1.4 局灶性腦梗死動物模型制作

參照Zea Longa線栓法制作大鼠左側大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）腦梗死模型［3］。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（350 mg／kg體重）麻醉，仰臥固定于手術臺上，經頸正中稍偏左切口，分離、暴露左側頸總動脈、頸內動脈及頸外動脈，結扎頸總動脈近段、頸外動脈根部及分支，在頸總動脈近分叉處剪一小口，經此插入直徑0.20 mm頭端圓鈍的漁線，經頸總動脈分叉處通過頸內動脈入顱至大腦中動脈的起始部以阻斷大腦中動脈血流，插入深度為（19.0±0.5）mm，結扎頸總動脈，縫合皮膚。制模成功的標準為大鼠蘇醒后表現為提尾時右側前肢內收屈曲；同側Horner征；爬行時向右劃圈；站立時右側傾倒。凡具有上述四項體征者列入研究對象。

1.5 神經功能缺損評定

各組大鼠在腦梗死后第1、7、14 d應用改良的神經功能缺損評分（modified Neurological Severity Scores，mNSS）方法進行神經功能評定［4］。神經功能按受損嚴重程度分為0～18分，0分為正常，18分為最嚴重神經功能缺失。mNSS 根據一系列的運動、感覺、反射和平衡試驗進行評分。每給1分表明大鼠不能完成規定的試驗或反射，因此評分越高，表明神經功能損害越嚴重。

1.6 組織標本制備及免疫組化檢測梗死周邊區大腦皮質GAP－43的表達水平

各組取6只大鼠在腦梗死后第7d神經功能評定結束后用過量的10%水合氯醛深度麻醉，開胸經左心室插管至升主動脈，先用100 ml生理鹽水快速沖洗血液，接著用4%多聚甲醛PBS 400 ml灌注固定，然后將大鼠斷頭取腦，置4%多聚甲醛中后固定過夜，之后石蠟包埋，行連續冠狀位切片。取相同層面的標本行免疫組化SABC法檢測GAP－43表達水平：切片常規脫蠟至水后加入3%H2O2甲醇溶液，室溫10 min；加入正常山羊血清封閉，室溫20 min；然后分別加入兔抗GAP－43 單克隆抗體，置濕盒4 ℃過夜；生物素標記的二抗，室溫10 min；鏈酶親和素－過氧化物酶溶液，室溫10 min；然后滴加新鮮配制的DAB－H2O2顯色液，室溫顯色5～10 min；自來水沖洗，脫水、透明、中性樹膠封片；組織標本置光鏡下觀察（放大倍數10×20）、照像，采用HPIAS－1000圖像分析系統測定梗死灶周圍頂葉皮質陽性表達物的吸光度值（OD 值）；每張切片隨機取5 個非重疊視野進行測定然后取其均值。

1.7 腦梗死灶周圍組織蛋白的提取及Western blot檢測NgR 蛋白的表達水平

各組取6只大鼠在腦梗死后第7 d神經功能評定結束后用過量的10%水合氯醛深度麻醉后快速斷頭取腦，在顯微鏡下用鋒利刀片切取左側梗死灶周圍頂葉腦組織，勻漿離心后取上清液Bradford法測定蛋白質含量。取20μg樣本經SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉印蛋白至（polyvinylidene difluo－ride，PVDF）PVDF膜，脫脂奶粉封閉，加兔抗NgR單克隆抗體或抗β－actin 單克隆抗體（滴度為1∶1000），置4 ℃過夜，加HRP 標記的山羊抗兔IgG（滴度為1∶1000），置室溫1 h，曝光顯像，采用凝膠圖像處理系統進行掃描拍照，應用BandScan V5.0版凝膠圖像軟件分析各目標條帶灰度值（A值），以NgR／β－actin表示NgR 相對水平。

1.8 BDA 皮質脊髓束順行示蹤

參照季達峰等報道的方法［5］。大鼠于腦梗死后第14 d用水合氯醛麻醉，將大鼠頭部固定在立體定位儀上，以前囟為參照點，沿矢狀縫作一矢狀中線，分別在前囟中心前1.0mm、前囟中心、前囟中心后1.0mm、前囟中心后2.0mm 水平上，距中線左右各1.5 mm、2.5 mm 分別鉆直徑約0.5 mm 的孔，共8個孔；將微量注射器固定在立體定向注射儀上，以定位好的孔作為注射點，將10% BDA 溶液緩慢注射到每個孔中，每次劑量0.2μl，每個孔分別在距大腦皮層表面1.0mm 和2.0mm 處各注射一次；每注射一個層面等待2 min，再進針，第二個層面注射完畢后，留針5 min，后緩慢退針；注射完畢后用骨蠟封住針眼，縫合頭皮；在大鼠BDA 注射注射2周后灌注取出腦及頸段脊髓，在中腦大腦腳及C1－3水平行連續冠狀位冰凍切片，片厚30μm；切片入1∶1000抗生物素蛋白－生物素－過氧化物酶復合溶液（用含0.3%Triton X－100 的0.01 mmol／L PBS 稀 釋）中孵育3 h，DAB 顯色，中性樹膠封片；每只大鼠在大腦腳水平及C1－3水平各取連續的3張切片在顯微鏡下觀察照像，采用HPIAS圖像分析系統計數5 個非重疊視野中BDA 染色陽性纖維的數目并取其平均值。

1.9 統計學處理

2 結 果

2.1 神經功能缺損評定

腦梗死后第1d，pNgR－shRNA1 組、pNgRshRNA2組、pCon 組及模型組mNSS 評分無明顯差異（P＞0.05）。腦梗死后第7、14 d，pNgR－shRNA1組、pNgR－shRNA2 組mNSS評分明顯低于pCon組及模型組（P＜0.05），而pCon組及模型組mNSS評分無明顯差異（P＞0.05）（圖1）。

圖1 神經功能缺損評定 各組與pCon組及模型組比較，＃P＜0.05，△P＜0.05

2.2 各組大鼠梗死周邊區大腦皮質GAP－43表達變化

各組大鼠梗死周邊區大腦皮質均可見GAP－43陽性表達細胞，其表達位于細胞胞漿，呈細顆粒狀。雖與正常對照組相比，腦梗死各組表達水平均有明顯增高（P＜0.05），但是與pCon組及模型組相比，pNgR－shRNA1組、pNgR－shRNA2 組 梗 死 灶 周 圍腦組織GAP－43的表達進一步增強，差異明顯（P＜0.05）（表1及圖3）。

表1 各組大鼠腦梗死周邊區大腦皮質GAP－43的表達（±s，OD 值）及NgR 相對表達量（±s，NgR／β－actin）

表1 各組大鼠腦梗死周邊區大腦皮質GAP－43的表達（±s，OD 值）及NgR 相對表達量（±s，NgR／β－actin）

注：與模型組及pCon 組比較，△P＜0.05，▲P＜0.05；與模型組比較，＃P＞0.05；與正常對照組比較，▽P＜0.05，＊P＜0.05

組別 n GAP－43表達水平NgR／β－actin表達水平正常對照組 6 0.13±0.011 0.14±0.036模型組 6 0.32±0.024＊ 0.41±0.058＊pCon組 6 0.29±0.022＃▽ 0.42±0.065＃▽pNgR－shRNA1組 6 0.45±0.031△ 0.26±0.043△pNgR－shRNA2組 6 0.43±0.040▲ 0.24±0.039▲

2.3 各組大鼠梗死周邊區大腦皮質NgR 表達水平

模型組及pCon組梗死周邊區大腦皮質均可見一定水平的NgR 表達，較正常對照組增高（P＜0.05）。與模型組及pCon 組相比，pNgR－shRNA1組、pNgR－shRNA2 組NgR表達明顯降低（P＜0.05）（表1及圖5）。

2.4 BDA 皮質脊髓束順行示蹤

各組大鼠在病變側大腦腳水平及病變對側C1－3水平脊髓均可見BDA 染色陽性纖維，與正常對照組相比，其他各組陽性纖維的數目明顯減少（P＜0.05）。與模型組及pCon 組相比，pNgR－shRNA1組、pNgR－shRNA2組大腦腳水平及C1－3水平BDA染色陽性纖維的數目明顯增多（P＜0.05）。同時觀察 發 現pNgR－shRNA1 組、pNgR－shRNA2 組經健側發出跨過中線的側枝神經纖維也較模型組及pCon組明顯增加（圖2及圖4）。

圖2 各組大鼠BDA 皮質脊髓束順行示蹤 各組與pCon組及模型組比較，P＜0.05

3 討 論

在針對CNS損傷后髓磷脂相關抑制物的研究中目前主要通過應用Nogo－A 抗體NI－l、髓磷脂或cDNA 疫苗、抗NgR 競爭性肽段等。國外相繼有多位學者通過立體定向腦內注射或鞘內注射的方式將NI－l應用到腦缺血大鼠的體內，結果表明接受治療的大鼠神經功能有明顯恢復，皮質脊髓束傳導纖維有明顯的再生及發生可塑性調節［6，7］。另有研究顯示，應用一種NgR 受體拮抗劑NEP1－40 能夠阻止其與Nogo－A 結合，NgR 不能被激活，于是發現軸突損傷減輕，再生增強［8］。這些中和性抗體或競爭性肽雖然不同程度上對抗了髓磷脂相關抑制因子的作用，促進軸索再生，但NI－1只能阻斷Nogo的軸突生長抑制作用，髓磷脂或cDNA 疫苗難以通過血腦屏障到達損傷局部，而且應用Nogo－A 抗體或髓磷脂疫苗治療不能阻斷Nogo、MAG、OMgp等所有抑制分子的作用。盡管分子途徑的NgR 抗體或抗NgR 競爭性肽段封閉Nogo蛋白與NgR 的結合，可能同時減輕這三個髓磷脂相關抑制因子的作用，但因其易受環境因素的影響，且肽段到達損傷部位的效率不高、作用時間短暫而限制了其在包括腦缺血在內的中樞神經系統損傷疾病中的實際應用。RNAi是由雙鏈RNA 介導的、在轉錄后mRNA 水平關閉相應序列基因表達的過程。在此過程中，基因可以進行正常轉錄，但不能正常積累mRNA，從而使基因在轉錄后mRNA 水平失活。通過RNAi技術直接沉默相關基因的表達來克服神經再生抑制因子的作用無疑是一種合理的選擇。Zubair Ahmed等的研究證實對體外培養的背根神經節神經元采用RNAi技術能有效沉默NgR、p75NTR及Rho－A mRNA，和對照組相比，其蛋白的表達分別下降100%、70%、和100%，上述基因沉默后背根神經節神經元軸突再生明顯增強［9］。本研究結果顯示，轉染RNAi質粒組腦梗死大鼠NgR 表達明顯降低，提示抑制NgR 表達的RNA 干擾作用是成功和有效的。有研究結果表明，局灶性腦梗死后6 h，Nogo－A及NgR 的表達即開始升高，24 h達到高峰，持續7 d左右逐漸恢復到基礎水平［10］。本研究選擇在大鼠腦梗死蘇醒后即注射RNA 干擾質粒，考慮在此時間段進行干預，其效果最佳。

圖3 各組大鼠腦梗死周邊區大腦皮質GAP－43表達水平（SABC×200倍）

圖4 各組病變側大腦腳水平及病變對側C1－3水平脊髓BDA 染色陽性纖維數（×400倍）

圖5 Western blot檢測各組大鼠梗死周邊區大腦皮質NgR 表達水平 A 為正常對照組；B為模型組；C 為pCon組；D 為pNgR－shRNA1 組；E 為pNgR－shRNA2組

腦梗死后神經重塑是其功能恢復的重要機制，而神經再生是其重塑的結構基礎之一。神經再生主要是軸突再生，即受損的軸突重新芽生，或周圍未受損的軸突發芽，實現重新支配；或者樹突分支增加、延長，可以提供更多接觸面重建軸－樹連接［11］。生長 相 關 蛋 白43（growth－associated protein 43，GAP－43）是位于神經元軸突生長錐中的組織特異性磷酸蛋白，主要作用是啟動生長錐的形成，引導、促進軸突生長。軸突出芽時GAP－43的表達增高，腦梗死后其表達時程發生變化，在24 h開始升高，7 d達高 峰［12］。本 實 驗 中 發 現NgR－shRNA1 組、pNgR－shRNA2組梗死灶周圍腦組織GAP－43 表達明顯增強，提示RNA 干擾下調NgR 的表達后因缺血受損的神經元軸突再生明顯增加，神經重塑增強。

腦梗死后皮質脊髓束的可塑性變化既包括病側神經纖維再生，也包括健側發出側枝進行代償。本實驗中發現RNA 干擾抑制NgR 表達的兩組大鼠病變側BDA 陽性神經纖維數目明顯增多，且發現經健側發出跨過中線的側枝神經纖維也明顯增加，這種皮質脊髓束可塑性變化的增強是RNA 干擾抑制NgR 表達后促進神經功能恢復的重要基礎。

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3 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke，1989，20（1）：84－91.

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7 Tsai SY，Markus TM，Andrews EM，et al.Intrathecal treatment with anti－Nogo－A antibody improves functional recovery in adult rats after stroke.Exp Brain Res，2007，182（2）：261－266.8 Hunt D，Mason MR，Campbell G，et al.Nogo receptor mRNA expression in intact and regenerating CNS neurons.Mol Cell Neurosci，2002，20（4）：537－552.

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