血管緊張素Ⅱ和纈沙坦對血管平滑肌細胞增殖和基質金屬蛋白酶9表達的影響

周 珂 于弋水

血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）的增殖和遷移是血管重構的直接原因［1］。細胞外基質（Extra—lularmatrix，ECM）的降解 與VSMC的 增 殖 和 遷 移 密 切 相 關［2］，MMP－9 是降解ECM 的關鍵酶。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是一種多功能的血管活性肽，研究證實AngⅡ是誘導VSMC增殖的重要因素，且此作用由血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）介導［3］，但AngⅡ在刺激VSMC增殖的同時是否影響MMP－9 的表達，AT1R 拮抗

劑是否影響此作用尚不清楚。本研究以體外培養的VSMC為觀察對象，研究了AngⅡ和對VSMC 增殖和MMP－9 表達的作用及AT1R 拮抗劑－纈沙坦（Valsartan）對AngⅡ作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 血管緊張素Ⅱ、兔抗鼠基質金屬蛋白酶－9（MMP－9）抗體購自北京博奧森（BIOS）公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；抗大鼠α平滑肌肌動蛋白單克隆抗體購自福建邁新生物技術司；SP免疫組化試劑盒購自武漢谷歌公司；Access RT－PCR 試 劑盒 購 自 美 國Promega 公 司；RNA 提取試劑Trizol、高糖的DMEM 培養基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司，引物由Gibco公司合成。

1.2 VSMC 的分離培養與鑒定 體質量150～180 g的雄體SD 大鼠購自武漢大學動物中心，斷頸法處死大鼠，無菌條件下迅速分離主動脈，組織貼壁法進行原代培養，選用第5～6代細胞進行實驗。當細胞生長至80%匯合時，按1×106個／ml接種到六孔培養板以及培養瓶中，待細胞長滿后用特異性人抗鼠α平滑肌肌動蛋白單克隆抗體的免疫組化法對VSMC進行鑒定拍片。

1.3 分組 將純化的VSMC 用0.125%胰蛋白酶消化下來后接種于96孔培養板中無血清培養基饑餓培養孵育24 h，接種密度為2×105／孔，每孔200 μl，空白組只加200μl培養液。待細胞生長融合后，按以下方法分組：AngⅡ組（A 組）：直接加入1×10－7mol／L的AngⅡ；AngⅡ＋Valsartan組（A＋V 組）：1×10－6mol／L Valsartan作用0.5 h后再加入1×10－7mol／L AngⅡ；Valsartan組（V 組）：直接加入1×10－6mol／L Valsartan；對照組：不加AngⅡ和Valsartan；各組分別作用24 h。

1.4 MTT 法檢測VSMC 的增殖率 分別收集各組的細胞和培養基，以單純的只有培養基者作空白對照，每孔加入0.5 mg／mL 的MTT20 ul反應4 h，加入二甲基亞砜200μl，在波長570 nm 處測定平均吸光度（A），每組重復6孔取其平均A 值。根據平均吸光度A 值計算VSMC 相對增殖率，相對增殖率＝（實驗組A 值－空白對照A 值）／（對照組A 值－空白對照A 值）×100%

1.5 免疫細胞化學法檢測MMP－9 蛋白的表達水平 按以上方法分組，作用24小時后分別收集各組的細胞，按照SP試劑盒說明書所示步驟進行操作。同時設陰性對照，磷酸緩沖液代替一抗。采用Image－Pro Plus system6.01專業圖像分析軟件進行圖像掃描，表達強度用平均吸光度（A）表示。

1.6 RT－PCR 法檢測VSMC 中MMP－9mRNA 的表達水平 （1）提取細胞總mRNA 并逆轉錄為cDNA：按以上方法分組，分別作用24小時后棄去培養基，每107個細胞加入1ml Trizol裂解核蛋白體提取總mRNA，按逆轉錄試劑盒操作步驟進行逆轉錄得到cDNA；（2）PCR 引物及擴增條件：MMP9 片段長 度 537bp；上 游 引 物 5’TCCACCAACTGAAGTCTCGCCT 3’，下 游 引 物 5’GCACAATCGCCATAATTATCC3’，內參β－actin，片段長度350bp，上游引物5’GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA3’，下游引物為5’CTCTTTGATGTCACGACGATTTC3’，擴增條件：48℃逆轉錄45 min，94℃放置2 min。循環條件為：94℃變性30 s，60℃退火2 min，68℃延伸2 min，共循環40次，最后一個循環68℃延伸7 min；（3）PCR 擴增產物的測定：擴增的PCR 產物在2%瓊脂糖凝膠中100mV下電泳15min，UVP 生物成像系統將凝膠成像，用Gelwork圖像分析軟件進行掃描和灰度值分析，以β－actin作為內參照，記錄并計算MMP－9 條帶與βactin的吸光度值的比值。

1.7 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件，所有數據均以均數±標準差（±s）表示，多組間數據比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 細胞培養的觀察和鑒定 原代培養4～10 d均可見有細胞從不同的組織塊邊緣游出。倒置顯微鏡下VSMC胞核多為卵圓形，有胞漿豐富，一個或多個核仁，少數細胞有雙核或三核。用SP 法免疫細胞化學染色，隨機抽取10 個視野（0.04 mm2／視野），計數平滑肌肌動蛋白抗原陽性細胞數和血管平滑肌細胞的純度。

2.2 AngⅡ和Valsartan對VSMC 增殖的影響AngⅡ組與對照組比較，VSMC 的增殖率升高；AngⅡ＋Valsartan組與AngⅡ組比較，VSMC 的增殖率降低，差異均明顯（P＜0.05）。V 組與對照組比較，VSMC的增殖率差異不明顯（P＞0.05）（表1）。

2.3 AngⅡ和Valsartan對MMP－9蛋白表達的影響AngⅡ組（0.12±0.009）與對照組（0.05±0.002）比較，MMP－9蛋白表達升高；AngⅡ＋Valsartan組（0.06±0.002）與AngⅡ組（0.12±0.009）比較，MMP－9蛋白表達降低，差異均明顯（P＜0.05）（表1）。

表1 各組VSMC的增殖率和MMP－9表達水平的比較

2.4 AngⅡ和Valsartan對MMP－9mRNA 表達的影響 AngⅡ組與對照組比較，MMP－9mRNA 表達升高；AngⅡ＋Valsartan 組與AngⅡ組比較，MMP－9mRNA 表達降低，差異均顯著（P＜0.05）（表1，圖1）。

圖1 MMP－9mRNA 的表達水平 M 為Marker；1為對照組；2為AngⅡ組；3為AngⅡ＋Valsartan組；4為Valsartan組

3 討 論

血管重構是引起心腦血管病等高血壓病并發癥的病理基礎，研究表明高血壓病小動脈的重構特點是以VSMC的增殖和遷移為主［1］。細胞外基質的降解與VSMC的增殖和遷移密切相關，其含量組成的變化也是高血壓病、動脈粥樣硬化等血管重構的重要機制［2］。

AngⅡ是血管病理生理學的重要介質，VSMC的異常增殖及細胞外基質合成均與AngⅡ有關。AngⅡ對VSMC功能的調節是多方面的，它可直接作用于VSMC，引發細胞收縮或增殖；還可通過誘導VSMC表達、釋放多種生物活性物質，產生一系列繼發效應；還可通過激活基質金屬蛋白酶導致細胞外基質重構。

ECM 異常積聚和降解引起血管重構是AS及血管損傷再狹窄等血管病變的重要原因［2］，基質金屬蛋白酶系（matrix metalloproteinases，MMPs）是介導此過程最重要的酶類，其中MMP－9是降解細胞外基質尤其是降解阻礙VSMC遷移的基膜成分的關鍵蛋白酶［4］。Mason等研究發現，MMP－9過度表達可以促進VSMC 遷移至血管內膜，減少內 膜 基 質 含 量［5］。為 了 探 討MMP－9 對VSMC 增殖和遷移的作用，Asahi M 等利用MMP－9 基因缺失的小鼠實施血管剝脫術后發現，VSMC 遷移和增殖明顯減少，MMP－9 活性在正常小鼠動脈檢測不到，然而損傷4 h后其活性明顯增加，在24 h達到最 高 峰，持 續 高 表 達 至7、14 d后 活 性 消 失［6］。VSMC在損傷6 d后遷移至內膜，與MMP－9 升高時間一致。說明MMP－9 參與調節VSMC 遷移與增殖，其中MMP－9在損傷早期表達對VSMC增殖并遷移的作用至關重要。Cho等利用MMP－9 裸鼠進行實驗也發現MMP－9 基因缺失不但有抗VSMCs遷移的作用，而且還能抗細胞增殖，從而抑制內膜增生［7］。

有研究表明MMP－9 的抑制劑BipS 可明顯抑制AngⅡ誘導的VSMC遷移［8］，提示我們AngⅡ促進VSMC遷移與MMP－9 有關。本實驗以大鼠胸主動脈的VSMC為研究對象，觀察0.1μmol／LAngⅡ對細胞增殖和MMP－9mRNA 和蛋白表達的影響，結果發現一定濃度的AngⅡ可以誘導動脈的VSMC 增 殖 和MMP－9mRNA 和 蛋 白 表 達 增 高，AngⅡ對血管重構的作用可能與其誘導VSMC 的MMP－9 的表達增加有關，其機制可能與活化一系列信號分子并使核轉錄因子（NF－KB）磷酸化激活有關，NF－KB是調控MMP－9基因的關鍵因子。

AngⅡ是通過其受體結合發揮作用的，研究表明AngⅡ導致的血管收縮、細胞增殖等促進重構作用都是通過AT1R 發生的［3］。纈沙坦是AT1R 的高度選擇性受體拮抗劑，有研究表明纈沙坦具有劑量依賴性地逆轉高血壓心室重構的作用，我們以前的研究證實纈沙坦可通過拮抗AngⅡ的局部作用逆轉或阻止腦血管重構而發揮腦保護作用［9］。本實驗用纈沙坦阻斷AT1R 后，發現與AngⅡ組相比，AngⅡ誘導VSMC的增殖和MMP－9的表達增高均受到部分阻斷，由此推測AT1R 介導了AngⅡ誘導的VSMC增殖和MMP－9的表達增高，AT1R 拮抗劑可抑制這種作用，減少VSMC 增殖和MMP－9的表達，這為高血壓病和動脈粥樣硬化等血管增殖性疾病的防治提供了理論依據。

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4 Jochen Kunz.Matrix metalloproteinases and atherogenesis in dependence of age.Gerontology，2007，53（2）：63–73.

5 Mason DP，Kenagy RD，Hasensta BD，et al.Matrix mctalloprotei－nase－9 overexpression enhances vascular smooth muscle cell migration and alters remodeling in the injured rat carotid artery.Circ Res，1999，85（12）：l179－1185.

6 Asahi M，Asahi K，Jung JC.Role for Matrix Metalloproteinase 9 After Focal Cerebral Ischemia：？Effects of Gene Knockout and Enzyme Inhibition With BB－94.Journal of Cerebral Blood Flow＆ Metabolism，2000，20（12）：681–1689.

7 Cho A，Reidy MA.Matrix metalloproteinase－9 is necessary for the regulation of smooth muscle cell replication and migration after arterial injury.Circ Res，2010，91（9）：845－851.

8 Saito S，Frank GD，Motley ED，et al.Metalloproteinase inhibitor blocks angiotensinⅡ－induced migration through inhibition of epidermal growth factor receptor transactivation.Biochem Biophys Res Commun，2002，294（5）：1023－1029.

9 周 珂，余紹祖，李庚山.纈沙坦對卒中易感型自發性高血壓大鼠腦血管結構的影響.臨床心血管病雜志，2003，19（4）：291－293.