鹿茸中次黃嘌呤的超聲輔助提取法研究

梁芳慧 靳丹虹 董麗丹

鹿茸為鹿科動物梅花鹿(Cervus nippon Temminch)或馬鹿(Cervus elaphus Linnaeus)的雄鹿密生茸毛的未骨化的幼角［1］。鹿茸具有增強免疫功能、抗氧化、抗疲勞和抗衰老等藥理作用［2］。在抗氧化及抗衰老作用中，鹿茸中的次黃嘌呤、對羥基苯甲醛和磷脂會抑制與神經系統老化有關的單胺氧化酶(MAO)的活性［3］。目前，測定次黃嘌呤含量的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)和高效毛細管電泳法［4，5］。本文將超聲輔助提取與反相高效液相色譜結合測定經焙干處理后鹿茸樣品中的次黃嘌呤的含量，并采用正交設計法對提取條件進行了優化。本方法簡便、準確、可靠，適用于焙干鹿茸樣品中次黃嘌呤的定量分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥 高效液相色譜儀(安捷倫1200型)，KQ5200超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)，JB/T5374-1991電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

次黃嘌呤對照品(北京奧博星生物技術責任有限公司，含量＞98%，批號:20040815);超純水，甲醇(色譜純)，乙醇(分析純)，冰醋酸(分析純)均購于天津大學科威公司;鹿茸經切片，焙干粉碎后過100目篩(鹿茸來源，長春市雙陽鹿場)。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件及系統適應性 色譜柱:AgilentTC C18(250 mm×416 mm，5 μm);流動相:含0.07%冰醋酸的3%甲醇溶液;流速:1.0 ml/min;檢測波長:254 nm;柱溫:20℃;進樣量20 μl。按次黃嘌呤峰計算，理論塔板數不低于3000。在實驗條件下次黃嘌呤的保留時間為9.59 min，與相鄰未知峰的分離度＞1.5。

1.2.2 樣品前處理 準確稱取焙干鹿茸樣品1.0000 g，置于250 ml具塞錐形瓶中，加50%乙醇40 ml，放入60℃水溫的超聲波中提取40 min后，以12000 r/min轉速離心3 min，取上清液于100 ml容量瓶中，用50%乙醇定容，再用0.45 μm濾膜過濾，濾液待用。

1.3 結果

1.3.1 測定波長的選擇 取次黃嘌呤的50%乙醇溶液，經紫外-可見分光光度計掃描，確定254 nm為檢測波長。

1.3.2 HPLC流動相的選擇 用冰醋酸含量不同的甲醇水溶液作為流動相進行比較實驗，結果表明0.07%冰醋酸的3%甲醇溶液作流動相，樣品中的次黃嘌呤能得到較好分離。

1.3.3 標準曲線的繪制 準確稱取5 mg次黃嘌呤標準品，置于50 ml量瓶中，加水定容至刻度，混勻。濃度為100 mg/L的標準品儲備液。取儲備液配制 1.0、2.0、5.0、10、15、20、25、30 mg/L標準溶液，按(2.2.1)色譜條件進行測定，繪制標準曲線。次黃嘌呤在1～30 mg/L濃度范圍內與峰面積具有良好的線性關系，回歸方程y=68.749x-8.0225，R2=0.9997。

1.3.4 超聲輔助提取條件的優化 試劑濃度、試劑體積、超聲時間、超聲溫度是影響超聲輔助提取的主要因素。本實驗選擇乙醇試劑濃度A分別為40%、50%和60%，試劑體積B(g:ml)分別為1∶20、1∶30和 1∶40，超聲時間 C 分別為 30 min、40 min和50 min，超聲溫度 D 分別為 40℃、50℃和 60℃為待考察的4種因素和3個水平，選用L9(34)正交表，進行實驗。

根據對正交實驗結果的考察和方差分析表明，各影響因素對焙干鹿茸中次黃嘌呤提取效果的影響順序為A＞C＞B＞D。焙干鹿茸中次黃嘌呤的最佳提取工藝為A2B3C3D2，即用40 ml50%乙醇60℃提取40 min，焙干鹿茸中次黃嘌呤的提取量最高。

1.3.5 精密度實驗 在(2.2.1)色譜條件下，將2 mg/L次黃嘌呤標準溶液連續進樣6次，每次進樣20 μL，測定結果RSD=2.6%(n=6)，表明本法具有一定的精密性，選定的色譜條件穩定。

1.3.6 穩定性實驗 準確稱取鹿茸樣品1.0000 g，按(2.2.2)對樣品進行前處理，每隔2 h取20 μL進樣，12 h內計算次黃嘌呤的含量變化，RSD ＜2.3%，提取液在12 h內穩定。

1.3.7 回收率實驗 準確稱取一定質量焙干鹿茸樣品(n=3)，分別加入低、中、高三種濃度的次黃嘌呤標準品，按(2.2.2)對樣品進行前處理，(2.2.1)色譜條件進行測定，計算回收率，結果表明平均加標回收率在97.5% ～102.9%間。

1.3.8 樣品測定 準確稱取兩種不同批次的焙干鹿茸樣品1.0000 g按最佳實驗條件提取和測定，結果兩種不同批次鹿茸樣品(n=3)中次黃嘌呤的含量分別為0.845 mg/g和1.074 mg/g。

2 討論

本文建立的超聲輔助提取、反相高效液相色譜測定焙干鹿茸樣品中次黃嘌呤的方法，具有良好的精密度和重現性，而且簡便快速，對設備要求低，可用于焙干鹿茸藥材中次黃嘌呤測定，且具有較好的實操性，能為鹿茸藥材的質量評價提供可靠的測定方法和參考依據。

［1］國家藥典委員會.中國藥典.北京:化學工業出版社，2000:264-265.

［2］王本祥，陳曉光.次黃嘌呤對單胺氧化酶的抑制作用.藥學學報，1989，24(8):573.

［3］楊秀偉.花鹿茸、馬鹿茸堿基成分的HPLC定量分析和其MAO活性抑制作用.中草藥，1995，26(1):17.

［4］周冉，李淑芬.RP-HPLC同時快速測定鹿茸藥材中尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷含量.藥物分析雜志，2009，29(4):575-578.

［5］阮婧華.毛細管區帶電泳法同時測定冬蟲夏草中多種核苷及其堿基的含量.沈陽藥科大學學報，2002，19(2)∶112.